聚肌胞免疫刺激下仔豬外周血單核細(xì)胞的基因表達(dá)分析

王彥平，王懷中，郭建鳳，王海飛，劉劍鋒，王繼英. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟(jì)南 5000；. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 0093

聚肌胞免疫刺激下仔豬外周血單核細(xì)胞的基因表達(dá)分析

王彥平1，王懷中1，郭建鳳1，王海飛2，劉劍鋒2，王繼英1
1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟(jì)南 250100；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193

聚肌胞(Poly I:C)是一種天然雙鏈RNA(Double strand RNA, dsRNA)的擬似物，能夠模擬病毒感染后所形成的 dsRNA及刺激機(jī)體產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)。文章以抗病力存在差異的大蒲蓮和長白仔豬為研究對象，分離外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，在20 μg/mL的Poly I:C的免疫刺激下體外培養(yǎng)24 h，對影響免疫應(yīng)答過程中的7個細(xì)胞因子(IRF3、IL6、IL8、IL10、TNFα、IFNγ和IFNα)和3個模式識別受體(TLR3、TLR4和RIG1)利用實時熒光定量PCR檢測Poly I:C免疫刺激組相對于對照組的基因表達(dá)變化倍數(shù)。結(jié)果表明：檢測的大部分細(xì)胞因子和受體(6個)表達(dá)量變化倍數(shù)很大，其中3種白細(xì)胞介素IL6、IL8和IL10免疫刺激變化倍數(shù)最大，平均變化倍數(shù)分別為 20.71、10.87和5.18倍。對不同個體和品種間的比較發(fā)現(xiàn)，不僅大蒲蓮和長白兩品種間(大蒲蓮豬的變化倍數(shù)平均高于長白豬)而且同品種的3頭全同胞仔豬間對Poly I:C免疫刺激的應(yīng)答也存在較大的變化。文章利用Poly I:C體外模擬dsRNA對PBMC的感染，為下一步篩選仔豬對Poly I:C刺激的免疫應(yīng)答基因及鑒定大蒲蓮豬特殊的抗性基因奠定了基礎(chǔ)。

聚肌胞；外周血單核細(xì)胞；細(xì)胞因子；模式識別受體

動物的血液由血漿和有形細(xì)胞兩大部分組成，不停地流動于動物機(jī)體的循環(huán)系統(tǒng)中，參與機(jī)體的代謝和免疫活動，與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。而且因其采集方法簡單，對機(jī)體的損傷小，是開展研究的重要組織材料。醫(yī)學(xué)研究表明，血液的表達(dá)譜比皮膚、肌肉、肝、腎和腦等組織的表達(dá)譜能更好地反映免疫系統(tǒng)的狀態(tài)[1,2]。其中，外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)主要指血液淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，是血液細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄最活躍的細(xì)胞。PBMC 可以體外培養(yǎng)并在免疫刺激的作用下，發(fā)生和體內(nèi)相似的免疫應(yīng)答，從而廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、傳染病和心血管病、癌癥和生物標(biāo)志物的研究中[3,4]。

抗病力包括機(jī)體對病原體的防御能力和病原體入侵后的免疫應(yīng)答能力，在正常的情況下表現(xiàn)不出來。利用活病原微生物作為免疫刺激源開展研究具有傳播疾病的風(fēng)險，受到較大限制，故在實際研究中一般選用和病原微生物作用機(jī)理相似的免疫刺激劑來替代。Poly I:C是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物，是一種人工合成的雙鏈 RNA(Double strand RNA, dsRNA)，作為天然 dsRNA的擬似物，能夠模擬病毒感染后所形成的dsRNA，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[5,6]。Poly I:C在人和模式生物上的免疫作用機(jī)理已經(jīng)比較清楚，它作為病原體模式分子被細(xì)胞上的模式識別受體識別后，通過銜接蛋白TICAM-1傳導(dǎo)信號，從而激活干擾素調(diào)節(jié)因子3、NF-κB和AP-1的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)I型干擾素和促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，激活自然殺傷性細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞[7,8]。近年來，為研究藍(lán)耳病、豬瘟和口蹄疫等傳染病的發(fā)病機(jī)制和防治措施，Poly I:C逐漸作為天然dsRNA的擬似物模擬RNA病毒感染豬的致病機(jī)制研究[9～12]。但是，目前僅利用 Poly I:C 模擬dsRNA對豬PBMC的感染，免疫刺激對細(xì)胞因子和受體基因的表達(dá)變化的研究還未見報道。

我國大多數(shù)地方豬種在抗病性和免疫力方面明顯優(yōu)于國外豬種[13,14]，但是人們對中外豬種抗病力差異的遺傳基礎(chǔ)和免疫機(jī)理卻了解甚少。本研究以抗病力強(qiáng)的大蒲蓮仔豬和抗病力弱的長白仔豬為研究對象，分離PBMC，利用Poly I:C免疫刺激，根據(jù)以往的研究報道，選擇了Poly I:C免疫刺激下機(jī)體激活或者誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞因子，如促炎癥細(xì)胞因子(IL6、IL8、TNFα)、抗炎癥細(xì)胞因子(IL10)，干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF3)和干擾素(IFNα 和IFNγ)，而且還選擇了幾個具有代表性的模式識別受體(TLR3、TLR4和 RIGI)，采用實時熒光定量 PCR技術(shù)檢測Poly I:C免疫刺激培養(yǎng)的豬PBMC的mRNA表達(dá)量，為RNA病毒感染的免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)理研究、我國地方豬種高抗病力優(yōu)異基因資源的挖掘及標(biāo)記輔助抗病育種提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與樣品采集

選擇飼養(yǎng)在相同環(huán)境下的分娩日齡相近的大蒲蓮和長白母豬各一窩，28日齡時斷奶。仔豬達(dá)35日齡時，從每窩中分別選取 3頭健康仔豬，前腔靜脈采血20 mL 注入EDTAK2抗凝管中，顛倒混合均勻。

1.2 PBMC的分離

外周血單個核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血中其他細(xì)胞不同，利用密度介于1.075～1.090之間的聚蔗糖-泛影葡胺(GE healthcare)分離液，應(yīng)用水平離心機(jī)，1500 r/min的離心速度下常溫離心20 min，離心后管內(nèi)液體分為 3層，在上、中層界面處有一以單個核細(xì)胞為主的白色云霧狹窄帶，即為要分離的 PBMC。用移液器小心吸取白色霧狀層，然后用PBS液洗滌兩次以充分去除血小板等雜質(zhì)。每頭仔豬20 mL血液分離出的PBMC中加70 mL含10%胎牛血清的 RPMI-1640液(Hyclone)，重新混懸細(xì)胞。臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，并用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.3 Poly I：C免疫刺激

將Poly I:C干粉(Sigma-Aldrich)溶于PBS中，稀釋至濃度為2 mg/mL儲存液，保存在-70℃?zhèn)溆?。為保證 Poly I:C為雙鏈 RNA結(jié)構(gòu)，稀釋液應(yīng)加熱至50℃，隨后自然冷卻至室溫。

每頭仔豬分離的70 mL的PBMC懸液平均分成2份，一份為免疫刺激組，添加2 mg/mL 的Poly I:C儲存液350 μL，細(xì)胞懸液中Poly I:C終濃度為20 μg/mL，然后分裝至2個150 cm2培養(yǎng)瓶中；另一份為對照組，35 mL的PBMC懸液直接分裝于2個150 cm2培養(yǎng)瓶中。5% CO2濃度和37℃溫度下培養(yǎng)24 h。

1.4 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

培養(yǎng)24 h后，分別收集Poly I:C免疫刺激組和對照組的PBMC。利用RNAiso Plus(TaKaRa)提取樣品的總RNA，用NanoDrop 2000分光光度計(賽默飛) 和Agilent 2100生物分析儀(安捷倫)檢測RNA 的質(zhì)量和濃度。取1 μg左右的RNA，先利用The Prime-Script RT reagent kit with gDNA Eraser (RR047A，TaKaRa)試劑盒中的gDNA Eraser降解RNA中殘留的DNA，以避免RNA中殘留的DNA對定量結(jié)果的影響，然后再利用該試劑盒中的 PrimeScript RT Enzyme反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)前，用雙蒸水對cDNA溶液進(jìn)行4倍稀釋。

表1 細(xì)胞因子、模式識別受體基因和內(nèi)參基因及其實時熒光定量PCR檢測中所用的引物信息

1.5 引物設(shè)計合成和實時熒光定量PCR

對于基因IRF3、IL10、IFNγ和TLR3(GenBank登錄號見表1)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，另外幾個基因使用參考文獻(xiàn)報道的引物序列[15～18]。內(nèi)參基因選用 B2M和 PPIA。本課題組前期研究[19]表明，用Poly I:C免疫刺激豬PBMC，聯(lián)合使用這兩個內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)的校正和標(biāo)準(zhǔn)化，能獲得準(zhǔn)確可靠的目的基因表達(dá)定量。本研究中所檢測的各細(xì)胞因子、受體和內(nèi)參基因信息以及所用的引物信息詳見表1。

本研究采用的實時熒光定量試劑盒為 Light-Cycler?480 SYBR Green I Master(Roche公司)，實時熒光定量儀器為 Roche公司的 Roche LightCycler?480。反應(yīng)體系為20 μL，包括：Blue-SYBR-Green mix 10 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水7 μL。擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃復(fù)性及延伸20 s，45個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個技術(shù)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用 2-ΔΔCt相對定量分析法[20]進(jìn)行各細(xì)胞因子和受體在 Poly I:C免疫刺激下相對表達(dá)量分析。2-ΔΔCt計算公式為 2-ΔΔCt=2-[(CT_target-CT_control)]sample A-[(CT_target-CT_control)]sample B。該公式中涉及兩個基因的CT值：目的基因的 CT(CT_target)和內(nèi)參基因的CT(CT_control)，其中內(nèi)參基因的CT采用T2M和PPIA的幾何平均數(shù)。兩個樣品Sample A和Sample B分別為同一頭仔豬PBMC樣品的免疫刺激組和對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 PBMC分離與培養(yǎng)

利用密度梯度離心方法，每頭仔豬20 mL血液分離出的PBMC重懸于70 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640液(Hyclone)中，細(xì)胞濃度在2～5×106/mL。經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，400倍顯微鏡下觀察，PBMC表面光滑，形態(tài)為大小不等的圓形細(xì)胞，其中 95%以上的PBMC為活細(xì)胞(圖1A)。培養(yǎng)24 h后，PBMC沉到底部，但是輕輕晃動細(xì)胞瓶，大部分細(xì)胞從細(xì)胞壁中脫落漂浮。經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，免疫刺激組和對照組PBMC在400倍顯微鏡下均可見細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)增多，細(xì)胞表面有鋸齒狀突起(圖1B)，但是Poly I:C免疫刺激組比對照組細(xì)胞表面突起和細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)稍多。細(xì)胞形態(tài)的變化提示，PBMC在有無刺激劑存在的條件下體外培養(yǎng)24 h細(xì)胞的形態(tài)均會發(fā)生一定的變化，但是在免疫刺激劑的作用下其形態(tài)改變更為明顯。

圖1 Poly I：C免疫刺激前后PBMC的形態(tài)(×400倍)

2.2 細(xì)胞因子和受體免疫刺激表達(dá)變化

分光光度計和生物分析儀檢測表明，各樣品RNA 的 UV260/280在 2.0左右、UV260/230≥1.5、RIN≥7.0 和28S/18S > 0.7，表明所提取的RNA樣品質(zhì)量非常好，適合進(jìn)行下一步實驗。 而且表1中目標(biāo)基因和參考基因引物的擴(kuò)增曲線呈典型的“S”型，融解曲線在 85～90℃之間出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的單峰，而在其他位置未有任何峰出現(xiàn)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，目標(biāo)基因和參考基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率變化范圍在 0.95～1.1之間，符合利用 2-ΔΔCt相對定量法進(jìn)行表達(dá)量分析的要求。實時熒光定量PCR后，基于2-ΔΔCt相對定量分析方法，計算豬Poly I:C免疫刺激組相對對照組的相對表達(dá)量，具體結(jié)果見表2和圖2。

從圖2中可以看出：在本研究中所采用的免疫刺激濃度(20 μg/mL)和體外培養(yǎng)時間(體外培養(yǎng)24 h)下，除了4個基因(IFNα、RIG1、TLR3和TLR4)外，其他 6個基因均發(fā)生了明顯表達(dá)量變化，但是因為個體間變異較大，差異均沒有達(dá)到顯著水平(t-檢驗，P>0.05)?？傮w來說，3種白細(xì)胞介素基因(IL6、IL8 和IL10)免疫刺激增加倍數(shù)最大，其中IL6最高(平均20.71倍)，其次為IL8(平均為10.87)，再次為IL10(平均5.18倍)。除了變化倍數(shù)較大的3種白細(xì)胞介素基因外，IFNγ和TNFα表達(dá)也有小量的增加，增加倍數(shù)平均分別為1.44和1.61倍。另外，本研究中，IRF3免疫刺激組的表達(dá)量為對照組表達(dá)量的0.66倍，表明免疫刺激組IRF3表達(dá)相比對照組的表達(dá)下降了。IFNα、RIG1、TLR3和TLR4這4個基因，雖然個別樣本的表達(dá)有增加或者下降，但是6個個體的平均而言沒有發(fā)生變化。

從圖2還可以看出，不同個體PBMC對Poly I:C免疫刺激的應(yīng)答變化很大。本研究中同一品種的 3個樣本取自同一窩母豬，全同胞個體間，有的免疫刺激基因表達(dá)量變化很大，有的則相對較小。而且對于IL6、IL8和IL10這3種變化倍數(shù)很大的白細(xì)胞介素基因，大蒲蓮豬的變化倍數(shù)平均高于長白豬，特別是大蒲蓮豬中的DP19個體的表達(dá)量變化最大，IL6、IL8和IL10變化倍數(shù)分別達(dá)68.45，24.54和13.16倍。

表2 Poly I：C免疫刺激24 h后細(xì)胞因子和受體的相對表達(dá)量

圖2 Poly I：C免疫刺激24 h后細(xì)胞因子和受體的相對表達(dá)量柱形圖

3 討 論

豬是我國主要的肉食來源，對畜牧業(yè)生產(chǎn)和食品行業(yè)都尤為重要。此外，家豬在生理結(jié)構(gòu)、行為學(xué)、營養(yǎng)需求以及遺傳基礎(chǔ)等方面比通常使用的其他實驗動物(大鼠、小鼠等)更接近于人類，是人類疾病研究的理想模式動物；同時其器官大小和質(zhì)量等被認(rèn)為比靈長類動物更適合于異種器官移植。這使家豬在醫(yī)學(xué)研究和藥物試驗上的具有重要意義，也因此推動了過去幾十年內(nèi)對豬免疫系統(tǒng)的研究。因此，對豬的免疫應(yīng)答進(jìn)行詳細(xì)、全面的研究，不僅尋找有助于提高豬抗病力的基因，而且對提高豬的健康動物福利以及人類的健康都受益匪淺。

細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞(如某些基質(zhì)細(xì)胞)合成和分泌的能調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能，參與免疫應(yīng)答和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)的小分子多肽或糖蛋白。人和模式生物中的研究表明Poly I:C與特異性受體結(jié)合后，可以激活或者誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子的表達(dá)，如激活I(lǐng)RF3、NF-KB 和AP-1的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)I型干擾素和促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，激活自然殺傷性細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞[7,8]。本研究中，聚肌胞免疫刺激24 h后3種白細(xì)胞介素基因(IL6、IL8和IL10)表達(dá)量大幅度增加(5.18～20.71 倍)，TNFα表達(dá)也有小量的增加(1.61倍)，與以往研究中Poly I:C可以誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的結(jié)果相一致。但是，本研究中，除了個別個體外，IFNα沒有檢測到表達(dá)量沒有變化，IRF3免疫刺激組測表達(dá)量比對照組的表達(dá)下降，這和以往報道中Poly I:C可以激活I(lǐng)RF3和誘導(dǎo)I型干擾素的報道不一致。對于本研究中一些細(xì)胞因子表達(dá)變化和以前人及模式動物中報道不一致的原因，一方面可能是由于免疫刺激試驗中Poly I:C的添加濃度和免疫刺激培養(yǎng)時間引起的。以前研究中利用脂多糖(LPS)進(jìn)行人和豬PBMC免疫刺激研究表明，細(xì)胞因子的表達(dá)水平受LPS濃度和刺激時間的影響[21,22]。另一方面，豬的PBMC在Poly I:C的免疫刺激下基因的表達(dá)變化和人及模式動物可能存在著大的差異。我們計劃對本研究中收集的樣本進(jìn)行mRNA測序，一方面驗證本研究基于qRT-PCR檢測的細(xì)胞因子和受體的基因表達(dá)結(jié)果，另一方面進(jìn)一步挖掘豬PBMC對Poly I:C免疫刺激的應(yīng)答基因，特別是大蒲蓮豬特異的免疫應(yīng)答基因。

本研究結(jié)果顯示對于IL6、IL8和IL10這3種變化倍數(shù)很大的白細(xì)胞介素基因，大蒲蓮豬的變化倍數(shù)平均高于長白豬。大蒲蓮豬是山東省體型較大的華北型黑豬，具有抗病耐粗、高繁性、肉質(zhì)好等優(yōu)良特性，特別是對豬繁殖與呼吸障礙綜合癥(PRRS) 等 RNA 類型的病原表現(xiàn)出強(qiáng)抗病力[23,24]。大蒲蓮仔豬對Poly I:C免疫刺激表現(xiàn)出的大的應(yīng)答變化可能是其對RNA類病毒高抗病力的原因之一。另外，本研究中同品種的3頭全同胞仔豬間對Poly I:C免疫刺激的應(yīng)答也存在很大變化。Clapperton等[13]對梅山和大白豬的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及急性時相蛋白等免疫指標(biāo)的檢測表明兩個品種的豬種間存在顯著的差別；Kapetanovic 等[25]利用5個品種 8～12周齡的仔豬巨噬細(xì)胞進(jìn)行LPS刺激試驗，研究表明一些免疫相關(guān)基因在不同品種豬、同品種內(nèi)不同的個體間存在顯著的表達(dá)差異；本課題組以前利用324頭38日齡的杜洛克公豬和二花臉母豬構(gòu)建的F2資源群體，活體肌肉內(nèi)注射Poly I:C進(jìn)行免疫刺激，發(fā)現(xiàn)免疫刺激前后T淋巴細(xì)胞亞群、血常規(guī)，IL10和IFNγ等水平在群體內(nèi)存在很大變化[9]。本研究及上述這些研究均表明不同品種、同品種不同個體之間存在抗病力的遺傳差異，由此不少育種學(xué)家提出從遺傳角度通過育種措施來提高畜禽抗病力[26,27]，這一觀點被普遍接受。

本研究表明，在20 μg/mL的Poly I:C濃度下體外培養(yǎng)24 h，豬PBMC發(fā)生了明顯的免疫應(yīng)答。但是，本研究中所檢測的細(xì)胞因子和受體只是免疫應(yīng)答過程基因中的一部分，而且每個豬種只有3個生物學(xué)重復(fù)，樣本數(shù)偏少，故本研究只是初步的探索，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對試驗結(jié)果進(jìn)一步驗證。

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(責(zé)任編委: 任 軍)

Gene expression analysis of porcine peripheral blood mononuclear cell in response to immune stimulation of Poly I：C

Yanping Wang1, Huaizhong Wang1, Jianfeng Guo1, Haifei Wang2, Jianfeng Liu2, Jiying Wang1
1. Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding, Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China; 2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Ministry of Agriculture, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China

Polyinosinic-polycytidylic acid (Poly I:C) is an analogue of natural double strand RNA (dsRNA), which can simulate the viral dsRNA and stimulate the immune response. In the present study, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from piglets of Dapulian and Landrace with different disease resistance, and stimulated with 20 μg/mL Poly I:C for 24 hours in vitro culture. The expression of several cytokines (IL6, IL8, TNFα, IL10, IRF3, IFNα and IFNγ) and three pattern recognition receptors (TLR3, TLR4 and RIG1) was determined by qRT-PCR. The results showed that, most of the cyto-kines or receptors had obvious expression change compared with the control (without Poly I:C stimulation), especially the three cytokine genes IL6, IL8 and IL10, whose average expression change times were 20.71, 10.87 and 5.18, respectively. Expression comparison between breeds and among individuals of the same breed indicated that there was obvious difference not only between Dapulain and Landrace (Dapulain higher than Landrace) but also among the three individuals of the same breed. Our study simulated the infection of dsRNA to host cells using Poly I:C, and provided experimental foundation for further study on selecting the immune genes in response to Poly I:C stimulation and identifying the unique disease-resistance genes of Dapulian.

Polyinosinic-polycytidylic acid (Poly I:C); peripheral blood mononuclear cell (PBMC); cytokine; pattern recognition receptors

2014-03-10;

2014-05-05

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31201779)，山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目(編號：2011LZ13-01, 02)，山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵

基金項目(編號：BS2013SW026)和山東省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目(編號：SDAIT-06-011-03)資助

王彥平，碩士，助理研究員，研究方向：豬的遺傳育種。E-mail: wangyanping03@163.com

王繼英，博士，副研究員，研究方向：豬的遺傳育種。E-mail: jnwangjiying@163.com

10.16288/j.yczz.2015.01.009

時間： 2014-9-24 10:33:30

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140924.1056.005.html