HaCaT 細(xì)胞中FUT4表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性分析

李洪艷，佟少明，燕秋

1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081；2. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，大連 116044

HaCaT 細(xì)胞中FUT4表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性分析

李洪艷1，佟少明1，燕秋2

1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081；2. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，大連 116044

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ(Fucosyltransferase Ⅳ，F(xiàn)UT4)在正常細(xì)胞中表達(dá)量很低，但其低表達(dá)的調(diào)控機(jī)制以及是否受其啟動(dòng)子甲基化調(diào)控并不十分清楚。文章采用Western blot、免疫熒光和Real-time PCR的方法檢測(cè)正常人永生化表皮細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞FUT4的表達(dá)，觀察DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC處理對(duì)FUT4表達(dá)的影響。應(yīng)用甲基化特異性PCR方法分析HaCaT細(xì)胞中FUT4啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，HaCaT細(xì)胞中FUT4的表達(dá)水平明顯低于人表皮鱗癌細(xì)胞A431和SCC12。5 μmol/L的5-aza-dC處理72 h的HaCaT細(xì)胞，其FUT4 mRNA水平明顯升高，并且與未經(jīng)5-aza-dC處理的對(duì)照組相比，U引物擴(kuò)增檢測(cè)到的產(chǎn)物量增加，M 引物擴(kuò)增檢測(cè)到的產(chǎn)物量明顯減少。這些結(jié)果表明，HaCaT細(xì)胞中FUT4的低表達(dá)可能與其啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化有關(guān)。

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ；低表達(dá)；甲基化；HaCaT細(xì)胞

細(xì)胞表面的糖蛋白或糖脂是細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間傳遞信號(hào)的紐帶，而糖蛋白和糖脂上的寡糖鏈?zhǔn)瞧湫惺构δ艿闹匾M成部分。其中，Lewis 寡糖如Lewis a (Lea)、sLewis a (sLea)、Lewis b (Leb)、Lewis X (LeX)、sLewis X (sLeX) 和Lewis Y (LeY)是寡糖中的一類，其共同特點(diǎn)是都含有巖藻糖分子 Fucose，因此這些寡糖又可稱為巖藻糖寡糖[1]。

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Fucosyltransferase，F(xiàn)UT)負(fù)責(zé)催化巖藻糖寡糖的合成，迄今為止，共發(fā)現(xiàn) 11個(gè)FUT，分別命名為FUT1-FUT11。其中FUT4是合成LeY 寡糖的關(guān)鍵酶，它以[Fucα1→2Galβ1→4Glc-NAcβ1→R]為受體，以α-1,3糖苷鍵將巖藻糖基(Fucose)連接到 N-乙酰葡萄糖上形成[Fucα1→2Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→R]，即 LeY寡糖分子。該寡糖存在于多種蛋白分子上，如表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR，從而完成蛋白分子之間、細(xì)胞之間的相互識(shí)別和作用。研究表明，F(xiàn)UT4和LeY在細(xì)胞生理及病理?xiàng)l件下的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用[2,3]。FUT4在上皮來(lái)源的癌中表達(dá)水平升高[4～8]。用FUT4的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中FUT4表達(dá)明顯增加，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用；而用FUT4 RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞，F(xiàn)UT4的表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞的增殖及移植瘤的生長(zhǎng)均被抑制[1,9,10]。腫瘤組織中的LeY寡糖表達(dá)水平比正常組織中的表達(dá)水平明顯升高。不同的腫瘤以及腫瘤的不同分期，LeY的表達(dá)量也不同，因此LeY的表達(dá)水平成為腫瘤相關(guān)性的診斷、治療、預(yù)后的一種標(biāo)志物[11,12]。用LeY的特異性抗體可以封閉表皮生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而抑制癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長(zhǎng)[13,14]。

然而，F(xiàn)UT4在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中差異表達(dá)的調(diào)控機(jī)理并不十分清楚，本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FUT4在人表皮鱗癌細(xì)胞A431和SCC12細(xì)胞中的表達(dá)水平與啟動(dòng)子的不同甲基化水平有關(guān)[l5]。本研究旨在探討正常細(xì)胞中 FUT4的表達(dá)水平及其是否也受啟動(dòng)子甲基化調(diào)控，為 FUT4在不同細(xì)胞中表達(dá)水平的差異性調(diào)控提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為臨床上癌癥的診斷和治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人永生化表皮細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞和人表皮鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，人表皮鱗癌細(xì)胞系SCC12細(xì)胞由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院皮膚病學(xué)系Dr. James Rheinwald 惠贈(zèng)。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于添加10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中(Gibibco公司)，培養(yǎng)條件5%CO2、37℃。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR

應(yīng)用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取HaCaT、A431和SCC12細(xì)胞的總RNA，具體操作如下：6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞加入1 mL Trizol，反復(fù)吹打混勻3～5 min，將細(xì)胞裂解液收集到 1.5 mL離心管里，冰上放置10 min。每管加入氯仿0.2 mL，充分振蕩15 s，室溫下靜置3～5 min。4℃、10 000 r/min離心15 min，將上清移入另外的離心管中。加入0.5 mL的異丙醇(或與上清等體積的異丙醇)，-20℃放置30 min。4℃、10 000 r/min離心10 min。棄異丙醇，用DEPC處理過(guò)的水配制70%乙醇洗滌沉淀。4℃、10 000 r/min離心5 min，棄乙醇，沉淀在空氣中自然干燥，加入50 μL DEPC水溶解沉淀，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和含量，并將濃度調(diào)成1 μg/μL。

用DNA酶消化后按照M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行常規(guī)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得 cDNA，然后采用染料法進(jìn)行 Real-time PCR，擴(kuò)增FUT4基因。FUT4擴(kuò)增引物為：5′-CTCAGGCCGTGCTTTTCCA-3′(Forward)和5′-GTAGTCCAACACGCGCAGAT-3′(Reverse)。GAPDH擴(kuò)增引物為：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′(Forward)和5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′(Reverse) (TaKaRa公司)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃復(fù)性10 s，45個(gè)循環(huán)，選取15～20個(gè)循環(huán)處的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。按照以上程序，進(jìn)行 3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)?；虮磉_(dá)的定量分析采用比較CT值法，GAPDH作為內(nèi)參基因，用以校正每個(gè)樣品中總RNA量的偏差。將比較CT值法得到的數(shù)據(jù)繪制成柱形統(tǒng)計(jì)圖，根據(jù)柱形圖縱坐標(biāo)的數(shù)值衡量 FUT4的相對(duì)表達(dá)量的高低及各樣本之間表達(dá)倍數(shù)關(guān)系。

1.2.2 5-aza-dC對(duì)細(xì)胞的處理

5-aza-dC (Sigma公司) 用冰醋酸配成0.5 mol/L的保存母液，-80℃保存。由于該藥極不穩(wěn)定，需現(xiàn)用現(xiàn)配，每個(gè)藥物處理周期前根據(jù)使用量取出適量母液稀釋成0.05 mol/L，并分裝成20 μL/管，-20℃保存。細(xì)胞鋪板 24 h后，用終濃度為 5 μmol/L 的5-aza-dC處理細(xì)胞，每24 h更換一次培養(yǎng)液，并向培養(yǎng)液中重新加入新鮮的5-aza-dC，藥物作用72 h后收取細(xì)胞，可用于提取總DNA，RNA或總蛋白。

1.2.3 甲基化特異性PCR(Methylated-specific PCR, MSP)

采用苯酚法提取總DNA。具體操作如下：6孔板培養(yǎng)細(xì)胞至90%以上的融合度，胰酶消化并離心。細(xì)胞沉淀中加入0.5 mL DNA 提取緩沖液，同時(shí)加入RNase，在37℃水浴中保溫30 min。然后加入2 μL蛋白酶K，并在50℃下保溫2 h。加入等體積的飽和酚，充分震蕩混勻，10 000 r/min離心10 min。將上層水相轉(zhuǎn)入另一個(gè) Ep管中，加等體積氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻后，10 000 r/min離心10 min。將上層水相轉(zhuǎn)入新的Ep管中，加入3 mol/L的NaAC 50 μL，2倍體積的無(wú)水乙醇，離心后沉淀用 70%乙醇離心洗滌一次，保留沉淀，自然干燥，加適量的無(wú)菌水或TE溶解。瓊脂糖電泳鑒定并用紫外分光光度計(jì)定量所提取的DNA，然后按照EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒(ZYMO REASCHER公司)說(shuō)明書(shū)操作，使非甲基化的CpG轉(zhuǎn)變成UpG，而甲基化的CpG不變。以試劑盒處理過(guò)的DNA為模板進(jìn)行甲基化特異性PCR。M對(duì)引物：5′-CGGGTTGTTTTTATAATTCGATC-3′和5′-AATAACGTCGACTTCCTACCGT-3′(TaKaRa公司)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；然后94℃ 30 s，48℃ 1 min，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。U 對(duì)引物：5′-TGGGTTGTTTTTATAATTTGATTGT-3′和5′-AAAATAACATCAACTTCCTACCATT-3′(TaKaRa公司)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；然后94℃ 30 s，45℃ 1min，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 Western blot

6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞，PBS清洗后，加入適量的蛋白變性裂解液，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞收集到1.5 mL離心管中，4℃冰箱放置2 h，期間在振蕩器上間歇震蕩3次。離心后，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，考馬斯亮藍(lán)法定蛋白含量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，調(diào)整每個(gè)樣品的總蛋白上樣量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的凝膠按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)移到 NC膜上。轉(zhuǎn)膜后，將膜放于 5 %脫脂奶粉中進(jìn)行封閉，封閉后根據(jù)分子量大小將膜剪成上下兩部分，并分別與FUT4、β-actin單克隆或多克隆抗體(Proteintech公司)免疫雜交，經(jīng)過(guò)夜結(jié)合，次日PBS清洗多余一抗后，進(jìn)行二抗結(jié)合，PBS清洗掉多余二抗后，采用ECL法顯示蛋白的表達(dá)[15]。

1.2.5 免疫熒光

在正常狀態(tài)下爬片培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng) PBS漂洗、冰丙酮固定、破膜、正常羊血清封閉，加入 FUT4特異性一抗孵育液(Santa Cruz公司)，37℃孵育1 h 或4℃過(guò)夜。細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗并加入羅丹明標(biāo)記的熒光二抗，37℃孵育1 h，PBS漂洗，封片后，細(xì)胞在熒光顯微鏡下掃描并拍照，檢測(cè) FUT4蛋白在細(xì)胞中表達(dá)情況[15]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，當(dāng) P＜0.05時(shí)具有顯著性差異，當(dāng) P＜0.01時(shí)具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 FUT4在人永生化表皮細(xì)胞系 HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)

采用Western blot的方法(圖1A)對(duì)HaCaT細(xì)胞中 FUT4的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，與作為對(duì)照的人表皮鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431和SCC12細(xì)胞相比，F(xiàn)UT4在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)量較低。

免疫熒光方法(圖1B)顯示，F(xiàn)UT4主要定位在細(xì)胞漿內(nèi)，HaCaT細(xì)胞中熒光強(qiáng)度明顯較A431細(xì)胞和SCC12細(xì)胞中弱，同樣表明FUT4在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)水平較低。

進(jìn)一步采用Real-time PCR方法(圖2)對(duì)HaCaT細(xì)胞中 FUT4的表達(dá)進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示A431和SCC12細(xì)胞中FUT4 mRNA的表達(dá)水平分別約是HaCaT細(xì)胞中的13倍和5倍。

2.2 5-aza-dC對(duì)HaCaT細(xì)胞中FUT4表達(dá)的影響

為了觀察DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC是否會(huì)對(duì)HaCaT 細(xì)胞中FUT4的表達(dá)水平有影響，將細(xì)胞用5 μmol/L的5-aza-dC 處理72 h，檢測(cè)FUT4的表達(dá)變化。Real-time PCR結(jié)果表明，與未經(jīng)藥物處理組相比，5-aza-dC處理 HaCaT細(xì)胞后，F(xiàn)UT4 mRNA的表達(dá)明顯增加，并與 A431細(xì)胞中的表達(dá)水平相當(dāng)(圖 2)。同樣的藥物處理也引起了 SCC12細(xì)胞中FUT4 mRNA表達(dá)明顯增加，而A431細(xì)胞中FUT4 mRNA表達(dá)基本不變。這一結(jié)果提示，HaCaT細(xì)胞中FUT4的表達(dá)水平和細(xì)胞中DNA甲基化水平可能有關(guān)。

2.3 5-aza-dC對(duì)HaCaT細(xì)胞中FUT4啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)的影響

圖1 FUT4在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 5-aza-dC對(duì)HaCaT細(xì)胞中FUT4 mRNA表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步確定HaCaT 細(xì)胞中FUT4的表達(dá)是否直接受FUT4啟動(dòng)子甲基化調(diào)控，利用軟件Meth-Primer(http//www.urogene.org//methprimer/indexl.html) 對(duì)FUT4啟動(dòng)子區(qū)的CpG島進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-29～-725 bp處存在兩個(gè)CpG島[15]，本文選擇-429～-671 bp處的CpG島，采用甲基化特異性PCR的方法對(duì)FUT4啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，5-aza-dC對(duì)HaCaT細(xì)胞處理前，使用M引物擴(kuò)增檢測(cè)到大量產(chǎn)物，U引物擴(kuò)增未檢測(cè)到產(chǎn)物。5 μmol/L的5-aza-dC處理HaCaT細(xì)胞72 h后，U引物擴(kuò)增檢測(cè)到大量產(chǎn)物，M引物擴(kuò)增未檢測(cè)到產(chǎn)物(圖3)。SCC12細(xì)胞加藥處理后也出現(xiàn)甲基化產(chǎn)物減少，非甲基化產(chǎn)物增加的趨勢(shì)，但沒(méi)有HaCaT細(xì)胞中的變化顯著。這一結(jié)果提示，F(xiàn)UT4在HaCaT細(xì)胞中的低表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)相關(guān)。

圖3 HaCaT細(xì)胞中FUT4啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)分析

3 討 論

細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂上的巖藻糖寡糖LeY在精卵識(shí)別、胚胎著床及發(fā)育等生理過(guò)程和腫瘤等病理過(guò)程中起著非常重要的作用。FUT4是合成 LeY的關(guān)鍵酶，定位于高爾基體上。研究表明，F(xiàn)UT4 和LeY在相同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中以及不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中其表達(dá)水平具有明顯差異，但調(diào)控這種表達(dá)差異的原因還不是很清楚。

Taniguchi等[16]研究表明，在急性髓性白血病和結(jié)腸癌細(xì)胞系中，F(xiàn)UT4轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)短不一樣，并確定了長(zhǎng)短轉(zhuǎn)錄本的增強(qiáng)子。楊雪松等[17]報(bào)道，在乳腺癌細(xì)胞中 HSF1 和 Sp1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控了FUT4的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖。Withers等[18]則證明Elk-1是組織細(xì)胞淋巴瘤U937細(xì)胞中FUT4表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并且FUT4基因符合CpG島的定義。近年來(lái)，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)改變被認(rèn)為是很多基因表達(dá)調(diào)控的重要手段[19～24]，也有研究證明巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT3、FUT7的表達(dá)受其啟動(dòng)子甲基化水平的調(diào)控[25,26]。在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了增殖能力弱的人表皮鱗癌細(xì)胞系SCC12細(xì)胞比增殖能力強(qiáng)的A431細(xì)胞中 FUT4啟動(dòng)子甲基化程度高，加入甲基化酶抑制劑5-aza-dC處理后，SCC12細(xì)胞中FUT4表達(dá)水平明顯提高，啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著降低[15]。

但 FUT4在正常細(xì)胞中的表達(dá)水平如何，是不是其表達(dá)也受啟動(dòng)子甲基化調(diào)控呢？本研究采用正常的人永生化表皮細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞以及人表皮鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431和SCC12細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT4在HaCaT、SCC12和A431細(xì)胞中的表達(dá)水平依次升高。這一結(jié)果提示，在正常的細(xì)胞中FUT4處于基礎(chǔ)表達(dá)水平，當(dāng)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變以后，F(xiàn)UT4的表達(dá)明顯增加。研究表明，F(xiàn)UT4的表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖、遷移能力相關(guān)[1,4,27]，少量的FUT4表達(dá)可以滿足正常細(xì)胞正常生理活動(dòng)的需要，而當(dāng)細(xì)胞惡性生長(zhǎng)后，就需要大量的 FUT4的表達(dá)，產(chǎn)生大量的LeY巖藻糖寡糖，從而加強(qiáng)細(xì)胞之間的識(shí)別，激活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性發(fā)展。

為了證明HaCaT細(xì)胞中FUT4的低表達(dá)是否與甲基化有關(guān)，本研究用 5 μmol/L的 5-aza-dC處理HaCaT細(xì)胞72 h后，檢測(cè)了基因表達(dá)水平及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的變化，結(jié)果表明，HaCaT細(xì)胞中FUT4 mRNA的表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明HaCaT細(xì)胞中 FUT4的表達(dá)和細(xì)胞中的甲基化水平相關(guān)，但不能確定5-aza-dC作用后FUT4表達(dá)的變化是受其自身啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的直接調(diào)控還是由于其他類似轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)變化從而間接引起的。通過(guò)軟件對(duì)FUT4啟動(dòng)子區(qū)的CpG島進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并選取其中的一個(gè)CpG島進(jìn)一步研究其甲基化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT4表達(dá)升高的同時(shí)，該CpG島的甲基化程度顯著降低，這一結(jié)果暗示，F(xiàn)UT4的表達(dá)可能是和其自身啟動(dòng)子的甲基化程度相關(guān)。

一般認(rèn)為，基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化抑制基因的表達(dá)，一方面是由于直接影響了轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，另一方面是由于啟動(dòng)子甲基化以后會(huì)與甲基化結(jié)合蛋白(Methyl-CpG binding proteins)結(jié)合，進(jìn)一步招募去已?；?HDAC)，共抑制蛋白(mSin3A)，使染色質(zhì)處于凝縮狀態(tài)，致使RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等不能結(jié)合到DNA上，從而轉(zhuǎn)錄被抑制。Zhu等[28]研究報(bào)道，p21Cip1基因的轉(zhuǎn)錄因子 Sp1/Sp3識(shí)別區(qū)周?chē)蛄械募谆梢灾苯訙p少該轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而影響基因轉(zhuǎn)錄。Zhang等[29]則發(fā)現(xiàn)甲基化酶抑制劑5-aza-dC處理癌細(xì)胞后，LHR基因的表達(dá)水平升高，并不是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子的活性或與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合數(shù)量發(fā)生變化，而是因?yàn)榇龠M(jìn)了去乙酰化酶復(fù)合物HDAC1/HDAC2/mSin3A從LHR啟動(dòng)子區(qū)解離，提高了乙?；?，從而促進(jìn)基因表達(dá)。在本研究中，與A431和SCC12兩種惡性細(xì)胞相比，HaCaT細(xì)胞可能由于不需要太多FUT4的表達(dá)，因此FUT4啟動(dòng)子區(qū) CpG島需要處于更高程度的甲基化狀態(tài)，啟動(dòng)子的高度甲基化致使轉(zhuǎn)錄因子不能與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，進(jìn)而大量減少 FUT4基因的轉(zhuǎn)錄，使 FUT4的表達(dá)維持在基礎(chǔ)水平，滿足細(xì)胞的正常生長(zhǎng)需要。但 FUT4啟動(dòng)子區(qū)從甲基化到去甲基化，基因從低表達(dá)到高表達(dá)，其啟動(dòng)子區(qū)上所結(jié)合的蛋白究竟發(fā)生了怎樣的轉(zhuǎn)變還有待于進(jìn)一步研究。

值得注意的是，SCC12細(xì)胞經(jīng)5-aza-dC作用72 h后，F(xiàn)UT4 mRNA的表達(dá)量雖然有所提高，但并沒(méi)有達(dá)到A431細(xì)胞中的表達(dá)水平。分析原因有以下幾種可能：第一，F(xiàn)UT4的表達(dá)很有可能還受其他因素的影響，如轉(zhuǎn)錄因子的活性和結(jié)合數(shù)量以及組蛋白的乙?；癄顟B(tài)等，多種方式參與的調(diào)控也見(jiàn)于其他基因的研究中[29]。相關(guān)文獻(xiàn)也表明，在不同的細(xì)胞中，細(xì)胞的不同狀態(tài)下，對(duì) FUT4的表達(dá)起主要調(diào)控作用的機(jī)制可能不同[16～18]。本文所選取的細(xì)胞是正常細(xì)胞和惡性程度不同的癌細(xì)胞，這種細(xì)胞之間的差異性很可能會(huì)形成相同的基因卻存在不同的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。第二，5-aza-dC是一種甲基化酶抑制劑，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)并參考文獻(xiàn)的報(bào)道，本文采用終濃度為5 μmol/L、作用時(shí)間72 h。由于細(xì)胞之間存在差異性，可能這個(gè)使用濃度和作用時(shí)間對(duì)SCC12細(xì)胞來(lái)講并不是最佳條件，因而藥物作用后雖然出現(xiàn) FUT4啟動(dòng)子去甲基化，基因表達(dá)水平升高的趨勢(shì)，但并沒(méi)有達(dá)到完全去甲基化，基因的表達(dá)水平也沒(méi)有達(dá)到最高。

本研究一方面為 FUT4在不同細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了參考依據(jù)；另一方面，由于所選擇的研究細(xì)胞是正常細(xì)胞和惡性程度不同的鱗癌細(xì)胞，在這些細(xì)胞中 FUT4的表達(dá)具有隨著惡性程度的升高而表達(dá)量增加，甲基化程度降低的趨勢(shì)。FUT4基因在臨床病人的樣本中如果也具有同樣的甲基化調(diào)控趨勢(shì)，那么檢測(cè) FUT4啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)將有望成為臨床上鱗癌的診斷及惡性程度分級(jí)的輔助手段，同時(shí)也為抗癌藥物的研發(fā)提供新思路。

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(責(zé)任編委: 方向東)

Correlation between FUT4 expression and its promoter methylation in HaCaT cells

Hongyan Li1, Shaoming Tong1, Qiu Yan2
1. College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China; 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Dalian Medical University, Dalian 116044, China

The expression level of fucosyltransferase Ⅳ (FUT4) is low in normal cells. The mechanism underlying regulation of FUT4 expression in normal cells remains elusive. In this study, Western blot, immunofluorescence and real-time PCR were used to analyze FUT4 expression in the immortalized human keratinocytes cells HaCaT. Methylated-specific PCR was used to investigate methylation status of FUT4 promoter. The results showed that the FUT4 expression level was significantly lower in HaCaT cells than squamous carcinoma cells A431 and SCC12. FUT4 mRNA expression was increased in HaCaT cells treated by 5-aza-dC (5 μmol/L), an inhibitor of DNA methyltransferase. Furthermore, using the primers to amplify the methylated fragment yielded PCR products and noproducts were yielded by the primers to amplify the unmethylated fragment in HaCaT cells. Unmethylated PCR products were obtained in HaCaT cells treated by 5-aza-dC, while methylated PCR products were not detected. These results suggest that the lower expression of FUT4 in HaCaT cells may be correlated with the methylation of CpG island in FUT4 promoter.

FUT4; low expression; DNA methylation; HaCaT cells

2014-07-09;

2014-08-19

李洪艷，博士，副教授，研究方向：腫瘤糖生物學(xué)，表觀遺傳學(xué)。Tel: 0411-85827090；E-mail: L-hongyan@163.com

燕秋，博士，教授，研究方向：糖生物學(xué)。E-mail: yanqiu63@126.com

10.16288/j.yczz.2015.01.007

時(shí)間： 2014-9-19 13:35:30

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140919.1335.001.html