響應(yīng)面法優(yōu)化內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇工藝

程俊文，賀 亮，鄒景泉*，方 茹，邱德有，胡傳久，魏海龍，蔣云鶴，王衍彬

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江省森林食品研究重點實驗室，浙江 杭州 310023；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091）

響應(yīng)面法優(yōu)化內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇工藝

程俊文1，賀 亮1，鄒景泉1*，方 茹1，邱德有2，胡傳久1，魏海龍1，蔣云鶴1，王衍彬1

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江省森林食品研究重點實驗室，浙江 杭州 310023；
2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091）

選擇產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌EF-04和葡萄糖、豆餅粉、乙酸鈉三種營養(yǎng)因子，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken組合設(shè)計和響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化內(nèi)生真菌液體發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的發(fā)酵工藝條件進行紫杉醇人工生產(chǎn)試驗。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，內(nèi)生真菌液體發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的最佳培養(yǎng)條件為葡萄糖25.54g/L、豆餅粉7.94 g/L、乙酸鈉5.64 g/L；此條件下的驗證試驗表明，實際紫杉醇得率為313.52 μg/L，與理論值基本吻合。

紫杉醇；內(nèi)生真菌；發(fā)酵；Box-Behnken；響應(yīng)面

紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是一種二萜類衍生物，是具有獨特抗癌機制的天然產(chǎn)物，分子式為C47H51NO14，最初從紅豆杉植物中分離得到[1]。經(jīng)臨床驗證，具有良好的抗腫瘤作用，特別是對癌癥發(fā)病率較高的卵巢癌、子宮癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年來國際市場上最熱門的抗癌藥物之一。隨著地球人口癌發(fā)率的增長，對紫杉醇的需求量明顯增大。目前臨床和科研所需的紫杉醇主要是從紅豆杉中直接提取。由于紫杉醇在植物體中含量極低，生產(chǎn)1 kg紫杉醇需要2 500棵左右成年紅豆杉樹木的原料，也因此造成了對紅豆杉的大量砍伐，致使其天然資源趨于枯竭，造成了生物多樣性和生態(tài)環(huán)境的極大破壞。

能合成紫杉醇的紅豆杉內(nèi)生真菌的發(fā)現(xiàn), 是紫杉醇資源研究的重要進展。自從Stierle等[2]證明短葉紅豆杉的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生抗癌藥物紫杉醇，對植物內(nèi)生真菌的研究更加引人注目。我國學(xué)者也發(fā)現(xiàn)了多種產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌[3～5]。

植物內(nèi)生菌是一種分布廣、種類多、生物學(xué)功能多樣的微生物資源庫。在與宿主植物長期共進化過程中，內(nèi)生菌可產(chǎn)生一系列具有抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制等作用的生物活性。由于內(nèi)生真菌生長迅速，易于進行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)所需的原料可以是來源廣泛、價格低廉的農(nóng)林副產(chǎn)物，因而利用內(nèi)生真菌生物制備紫杉醇，被認(rèn)為是破解紫杉醇來源的最有效的解決方法。

響應(yīng)曲面法（response surface methodogy，RSM）是建立一個包括各因素的一次項、平方項和任何兩個因素之間的一級交互作用項的數(shù)學(xué)模型。目前該方法已廣泛用于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化和酶解等生化反應(yīng)優(yōu)化和模型建立中[6～8]。本實驗以紫杉醇為目標(biāo)產(chǎn)物，利用Box-Behnken設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成來提高內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的產(chǎn)量，為以后的發(fā)酵和放大實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

菌株來源：產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌EF-04，分離自南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei），本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面PDA 活化菌種用。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L、NH4NO35 g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L。

《方案》特別指出，堅決治理校外培訓(xùn)機構(gòu)的違法違規(guī)培訓(xùn)活動，凈化外部環(huán)境，去除學(xué)前教育“小學(xué)化”的“外在推手”。未經(jīng)教育部門批準(zhǔn)，任何組織和個人不得以家教、咨詢、文化傳播、公益課堂等名義向?qū)W齡前兒童開展培訓(xùn)業(yè)務(wù)。嚴(yán)禁校外培訓(xùn)機構(gòu)開設(shè)學(xué)前班、幼小銜接班以及其他形式的以學(xué)齡前兒童為培訓(xùn)對象的半日制或全日制培訓(xùn)班。禁止校外培訓(xùn)機構(gòu)開展以語文、數(shù)學(xué)、英語等小學(xué)課程為內(nèi)容的、面向?qū)W齡前兒童的培訓(xùn)活動。校外培訓(xùn)機構(gòu)培訓(xùn)時間不得和幼兒園保育教育服務(wù)時間相沖突。嚴(yán)禁校外培訓(xùn)機構(gòu)的宣傳廣告進入學(xué)校和幼兒園，禁止校外培訓(xùn)機構(gòu)在學(xué)校和幼兒園大門口散發(fā)宣傳廣告。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L、NH4NO35 g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng) 從母種試管中切出蠶豆大小的菌絲塊接種于斜面的中部，25℃培養(yǎng)10 d。

1.3.2 液體種子培養(yǎng) 將活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種于液體培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶裝培養(yǎng)基150 mL于25℃，120 r/min培養(yǎng)7 d。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng) 采用二級搖瓶，500 mL三角瓶裝液量150 mL，液體菌種接種量為10%，于25℃，120 r/min培養(yǎng)。1.4 響應(yīng)面法實驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖、豆餅粉、乙酸鈉3個因素，運用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理[8～9]，采用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計，利用Design Expert 8.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。自變量的試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗因素及水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of RSM

1.5 分析方法

1.5.1 菌絲干重測定 取100 mL發(fā)酵液，在3 000 r/min離心20 min，經(jīng)自來水洗滌多次后，將菌絲體在105℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.5.2 紫杉醇含量測定 發(fā)酵產(chǎn)物（包括菌絲體和發(fā)酵液）細(xì)胞超生破碎后的混合抽提物。HPLC色譜條件：色譜柱為Agilent EclipseXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm），流動相為甲醇—水（65：35），檢測波長為228 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫為35℃，進樣量為20 μL[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果。

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗。共有17個試驗點，其中12個為析因點，5個零點試驗用以估計試驗誤差。以紫杉醇得率為響應(yīng)值，試驗方案及結(jié)果見表2。

2.2 回歸模型建立及方差分析

利用Design Expert 8.05軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行分析[9]，獲得紫杉醇得率對葡萄糖、豆餅粉和乙酸鈉的多元二次回歸方程：

Yield = 322.20＋3.21X1＋7.07X2＋22.95X3-3.87X1X2＋4.39X1X3-9.56X2X3-28.21X1X1-19.36X2X2-14.47X3X3

由表3方差分析可知，以紫杉醇含量為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果達到極顯著水平，P值均＜0.000 1；模型的決定系數(shù)R2= 0.991 5，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數(shù)Adj R2= 0.980 6，說明該模型能解釋98.06 %響應(yīng)值的變化；模型的失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，表3中模型失擬項的P值為0.382 8，大于0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據(jù)表3的顯著性分析結(jié)果，X2、X3、X1X1、X2X2、X3X3及X2X3的交互項對紫杉醇的合成均顯著（p＜0.05）影響。綜合以上表明這個模型建立的回歸方程能運用于內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA on regression model

2.3 響應(yīng)面圖形分析

分別將模型中的葡萄糖、豆餅粉及乙酸鈉的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖1、圖2、圖3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇最顯著的因素為乙酸鈉（X3），表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。葡萄糖（X1）響應(yīng)面弧度變化平緩，說明對響應(yīng)值影響相對較小。

此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖1、圖2、圖3中可以看出，X1與X3、X2與X3交互作用顯著；X1與X2無交互作用，表明一因素對響應(yīng)值的影響規(guī)律并不會隨著另一因素的改變而有明顯變化。

2.4 驗證實驗

通過SAS軟件對上述方程進行求解，得到最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖25.54 g/L，豆餅粉7.94 g/L，乙酸鈉5.64 g/L，其紫杉醇產(chǎn)量理論值可達331.62 μg/L。

為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測值與實際實驗值之間的相關(guān)性，即檢驗響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對內(nèi)生真菌在預(yù)測的最優(yōu)發(fā)酵條件下紫杉醇產(chǎn)量進行實驗驗證。實驗中葡萄糖、豆餅粉和乙酸鈉的優(yōu)化值分別為25.54、7.94、5.64 g/L，三組平行實驗，測得紫杉醇得率分別為323.15、308.14、309.26 μg/L，實際紫杉醇得率平均值為313.52 μg/L，達到了回歸模型預(yù)測理論值的94.54%，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測紫杉醇產(chǎn)量。

圖1 葡萄糖和豆餅粉交互影響紫杉醇得率的曲面圖和等高線Figure 1 Response surface and contour of interaction of glucose and soybean powder on Taxol yield

圖3 豆餅粉和乙酸鈉交互影響紫杉醇得率的曲面圖和等高線Figure 3 Response surface and contour of interaction of soybean powder and sodium acetate on Taxol yield

3 結(jié)論

本研究選擇產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌EF-04和葡萄糖、豆餅粉、乙酸鈉三種營養(yǎng)因子，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計及三因素三水平的響應(yīng)面分析，通過二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合，預(yù)測了內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇最佳培養(yǎng)基條件為：葡萄糖25.54 g/L，豆餅粉7.94 g/L，乙酸鈉5.64 g/L，紫杉醇得率理論值可達331.62 μg/L。驗證實驗中紫杉醇實際得率為313.52 μg/L，與預(yù)測值十分接近，證明了該實驗方法的穩(wěn)定性。

[1] Wani M C, Taylor H L, Wall M E, et al. Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of Taxol, a novel antileukemic and antitumoragent from Taxus brevifolia[J]. J Am Chem Soc 1971, 93(9)： 2325-2327.

[2] Stierle A , Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pacific yew[J]. Science, 1993, 260（5105）：214-216.

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[7] 王允祥，呂鳳霞，陸兆新. 杯傘發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27（3）：89-94.

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[9] 費榮昌. 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理（第四版）[M]. 無錫：江南大學(xué)出版社，2001.

Optimization of Fermentation Conditions for Taxol Production from Endophytic Fungus by Response Surface Methodology

CHENG Jun-wen1，HE Liang1，ZOU Jing-quan1，F(xiàn)ANG Ru1，QIU De-you2，HU Chuan-jiu1，WEI Hai-long1，JIANG Yun-he1，WANG Yan-bin1

（1. Key Laboratory of Forest Food of Zhjiang, Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China; 2. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China）

Based on the results of single factor experiment, three levels and three factors of Box-Behnken design was employed combining with response surface methodology (RSM) to optimize the fermentation conditions for taxol production from endophytic fungus. The result showed that the optimal fermentation conditions were as follows: glucose 25.54 g/L, soybean powder7.94 g/L and sodium acetate 5.64g/L. Verification test demonstrated that the average yield of taxol was 313.52 μg/L, similar to theoretical value of 331.6 2μg/L.

taxol; endophytic fungus; fermentation; Box-Behnken; Response surface methodology (RSM)

S718.8

：B

1001-3776（2015）06-0068-05

2015-06-08；

2015-10-05

浙江省省院合作林業(yè)科技項目（2013SY17）；浙江省科技廳院所專項項目（2014F30001）；浙江省自然科學(xué)基金項目（LQ15C160001）;國家自然科學(xué)基金項目（31170628,31300567）、中央級公益性科研院所項目（RIF2014-01）的部分研究內(nèi)容

程俊文（1981-），男，安徽省蕪湖人，碩士，副研究員，從事森林食品及林源中藥活性成分開發(fā)研究；*通訊作者。