進展期尋常型銀屑病患者皮損中IL-22的表達

張曉嵐1，陳洋，姜奕

（1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 錦州 121000；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽 110001）

進展期尋常型銀屑病患者皮損中IL-22的表達

The Expression ofIL-22 in Skin Lesionsof Patientswith Advanced Psoriasis Vulgaris

張曉嵐1，陳洋2，姜奕2

（1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 錦州 121000；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽 110001）

通過應用實時定量PCR以及免疫熒光檢測方法對31例進展期尋常型銀屑病患者的皮損冰凍標本進行檢測，分析其皮損中的IL-22的表達。結果發(fā)現(xiàn)，進展期尋常型銀屑病患者皮損IL-22mRNA的表達與正常對照組比較明顯增高（P＜0.05）。因此認為，IL-22在進展期尋常型銀屑病患者的皮損中呈高表達，進而說明其與尋常型銀屑病的發(fā)病密切相關。

IL-22；尋常型銀屑病

尋常型銀屑病是一種常見的慢性復發(fā)性的炎癥性皮膚病，發(fā)病率在北方患者中較高［1］，對于發(fā)病機制的研究眾多，確切機制尚不清楚，近年來有部分國外學者通過大量研究發(fā)現(xiàn)Th17細胞在銀屑病發(fā)病中起到一定的作用［2］，而IL-22是Th17細胞分泌的重要細胞因子［3］。因此本研究通過應用實時定量PCR以及免疫熒光檢測方法對31例進展期尋常型銀屑病患者的皮損冰凍標本進行檢測，分析皮損中IL-22的表達，進而揭示IL-22與尋常型銀屑病發(fā)病機制的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

31例進展期尋常型銀屑病患者皮損取自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科門診及病房，通過兩名以上副主任醫(yī)師進行確診為進展期尋常型銀屑病。取材前均未應用維A酸、環(huán)孢素等藥物治療；男20例，女11例，年齡27～88歲［（63.5±17.9）歲］。16例正常對照組皮膚組織標本均取自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚外科患者正常皮損，男9例，女7例；年齡49～78歲［（63.7±8.7）歲］。

1.2 實驗方法

1.2.1 設備及材料：低溫恒冷切片機（德國leica-CM1900型）；CCD圖像采集相機；Olmpus光學顯微鏡（CH，日本）；電熱恒溫水箱（tdw-2002型，河北黃驊航天儀器廠）；-70℃深低溫冰箱（日本Sanyo公司）；實時定量PCR儀（日本TaKaRaTP800型）。鼠抗人IL-22單抗（美國R＆D公司）；驢抗鼠IgG的熒光二抗（美國R＆D公司）；IL-22 Real-time PCR引物、β-actin Real-time PCR引物（上海生工）。

1.2.2 實驗引物設計：利用http：//www.ncbi.nlm.nih. gov網(wǎng)站查取了IL-22基因mRNA的序列，通過序列比對后得到相應的基因組序列，從而應用Primer 5.0軟件設計IL-22基因外顯子區(qū)的實時定量PCR所需的引物，并經過上海生工公司進行合成，其序列如下：IL-22上游引物序列為：ACAACACAGACGTTCGTCTCATTG；IL-22下游引物序列為：GAACAGCACTTCTTCAAGGGTGA；β-actin作為內參照基因，上游引物為TGGCACCCAGCACAATGAA，下游引物為CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA。

1.2.3 實時熒光定量PCR：（1）提取總RNA：利用TRIZOL溶液和氯仿提取總RNA，并利用紫外分光光度計測量其純度及濃度，保存于-80℃，將RNA用TaKaRa試劑盒反轉錄為cDNA。（2）實時定量PCR步驟：按照試劑盒進行RT反應：25 μL反應體系的配制：SYBR Prime Ex Taq（2×）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）1μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2.0 μL。IL-22的反應條件為：預變性，95℃30 s，1個循環(huán)；PCR反應：變性，95℃5 s，退火，60℃30 s，共40個循環(huán)。IL-22的基因表達的相對變化用△△Ct法處理數(shù)據(jù)。

1.2.3 免疫熒光檢測：OCT包埋標本，在冰凍切片機內常規(guī)切片（5 μm），用丙酮固定。標本切片滴加PBS液于已知抗原標本片，10 min后，滴加PBS適當稀釋過的一抗，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋濕盒內，在37℃保溫1 h。取出玻片，用PBS溶液反復沖洗2次，然后按順序過PBS三缸浸泡，每缸需5 min，不時振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴稀釋后的熒光標記的二抗。在37℃內保溫1 min。取出玻片，用PBS沖洗2次，然后按照一定順序過PBS三缸浸泡，每缸5 min，不時振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加1滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。

1.2.4 實驗結果的判定：在熒光顯微鏡高倍視野下觀察，觀察其標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：（-）為無熒光；（±）熒光極弱的，視為可疑熒光；（+）為熒光較弱的，但清楚可見；（++）為熒光明亮；（+++～++++）為熒光閃亮。所取的標本的強度分級在200倍的放大倍數(shù)下，由同一個實驗者進行操作完成質量控制。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)運用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計，計量資料分析符合正態(tài)分布，用x±s表示，兩樣本均數(shù)間比較利用t檢驗（方差齊時）以及校正t檢驗（方差不齊時）。計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 熒光實時定量PCR的結果

進展期北方尋常型銀屑病患者與正常對照組相比較，患者皮損中IL-22 mRNA的相對表達量（13.80±3.41）明顯高于正常對照組（9.26±1.96），差異有統(tǒng)計學意義（t=-5.636，P=0.005），見圖1。

圖1 尋常型銀屑病IL-22的溶解曲線

2.2 免疫熒光實驗結果

免疫熒光法可見，在進展期尋常型銀屑病皮損中IL-22高表達在表皮的角質形成細胞內（圖2），正常對照組皮損則不表達IL-22（圖3）。與正常對照組皮損相比較，尋常型銀屑病皮損中IL-22的表達明顯升高（χ2=10.44，P＜0.05），見表2。

表2 進展期尋常型銀屑病皮損和正常皮膚中IL-22表達的比較

圖2 在銀屑病表皮中角質形成細胞內IL-22呈熒光強陽性表達 × 200

圖3 正常對照表皮中IL-22呈熒光陰性表達 ×200

3 討論

銀屑病是一種以鱗屑性紅斑為主要臨床表現(xiàn)的常見復發(fā)性慢性炎癥性皮膚病，按臨床表現(xiàn)分型為4型，其中尋常型銀屑病最常見，通常認為發(fā)病與多基因的遺傳、細菌或病毒感染、免疫、內分泌、神經及精神因素等多重方面有關，其中免疫學研究為近年來的熱點。傳統(tǒng)學說中認為Th1細胞在其發(fā)病中起到重要的作用。而近年來Th17細胞的發(fā)現(xiàn)讓國內外學者對其與尋常型銀屑病的發(fā)病之間的聯(lián)系進行了更多的研究。

IL-22是2000年Renauld等［4］發(fā)現(xiàn)，作為IL-10細胞因子家族中的一員，也是TH17細胞中的一個重要的效應分子，由179個氨基酸殘基相組合［5］，參與人體的免疫功能，與多種免疫性疾病發(fā)病有關［6，7］。近年來國外學者通過對IL-22在尋常型銀屑病患者發(fā)病中所起作用的相關研究中發(fā)現(xiàn)：（1）IL-22通過激活角質形成細胞，從而降低了促角質形成細胞分化的相關因子（如角蛋白1、角蛋白10、絲聚合蛋白原、激肽緩解酶7等）的表達，進而抑制了角質形成細胞的終末分化［8，9］。（2）IL-22聯(lián)合TNF-α等細胞因子促進State3的磷酸化并且上調了Stat3的表達，從而促進尋常型銀屑病角質形成細胞的增生以及炎性反應的形成［10］。同時IL-22通過上調了S100A7、S100A8、S100A9的表達，且誘導角質形成細胞表達β-防御素，抵抗了相關微生物的侵襲，并抑制了炎性反應的發(fā)生，從而調控并且維持了表皮細胞的穩(wěn)定性［11］。（3）IL-22能通過與IL-17、IL-20、IL-23等其他細胞因子的相互作用，從而起到擴大炎性反應，促進銀屑病棘層增生的作用［12］。（4）IL-22主要在角質形成細胞中表達，但有一部分也可以表達于表皮成纖維細胞中［12］，而本實驗在免疫熒光結果中銀屑病患者皮損的表皮IL-22高表達，也驗證了這一觀點。

目前，國內對于IL-22與尋常型銀屑病間關系的研究探討多集中在血清學檢測，針對IL-22在本病患者的皮損中表達的研究較少。本實驗通過應用實時定量PCR法及免疫熒光的檢測技術對IL-22在尋常型銀屑病患者和正常對照組患者的皮損中的表達進行了對比，從而發(fā)現(xiàn)進展期銀屑病組患者的皮損中IL-22的表達明顯高于正常對照組（P＜0.05），此結果提示IL-22與尋常型銀屑病患者的發(fā)病有著密切的聯(lián)系。本研究提出了銀屑病免疫治療的新方向，也提供了基因藥物治療的一個新思路。

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（編輯武玉欣）

R758.63

A

0258-4646（2015）04-0362-03

張曉嵐（1984-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

姜奕，E-mail：jiangyi@hotmail.com

2014-09-13

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