Cocktail法評價清熱養(yǎng)心顆粒對大鼠體內(nèi)P450酶活性的影響研究

吳 磊， 陸 超， 戴國梁， 王 珂

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029；3.徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221009）

細(xì)胞色素P450酶(CYP450)是機體內(nèi)最重要的代謝酶系統(tǒng)，可催化多種內(nèi)源性、外源性化合物的氧化反應(yīng)，在藥物和致癌物代謝活化過程中具有非常重要的作用.有些藥物經(jīng)CYP450酶系代謝后，轉(zhuǎn)化為活性代謝物，藥效增強；有些藥物經(jīng)CYP450代謝后，藥效降低或消失[1,2].肝臟是藥物代謝的主要場所，因此，評價外源物對肝臟藥物代謝酶的誘導(dǎo)或抑制作用尤為重要[3,4]，已有大量實驗報道化學(xué)合成藥物誘導(dǎo)或抑制CYP450酶活性，而有關(guān)中藥對CYP450影響的報道并不多見[5].

清熱養(yǎng)心顆粒由金銀花、黃連、酒黃精、百合、山豆根和甘草組方而成，全方具有清熱解毒，養(yǎng)心安神之功效，是新型的治療病毒性心肌炎藥物[6].臨床廣泛用于治療熱毒侵心、氣陰兩傷、心神失寧的病毒性心肌炎以及合并心律失常、心悸胸悶等.

本實驗采用"Cocktail"探針?biāo)幬锓ǎㄟ^考察清熱養(yǎng)心顆粒對大鼠體內(nèi)CYP450酶5種亞型（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1）的影響，提示與相關(guān)藥物存在相互作用的可能性，指導(dǎo)那些有多重代謝途徑的藥物的劑量設(shè)計，降低和避免臨床聯(lián)合用藥時由于相互作用引起的不良反應(yīng)發(fā)生.

1 材料

1.1 藥品與試劑

清熱養(yǎng)心顆粒（江蘇省中醫(yī)院制劑，批號1307001，規(guī)格：10g/袋），注射用奧美拉唑鈉（江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司委托杭州澳亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號14010126，規(guī)格：含奧美拉唑40mg/支），甲苯磺丁脲(Tolbutamide)對照品（Sigma，017K1025），氯唑沙宗(chlorzoxazone)對照品（Sigma，017K1385），茶堿 (theophylline)對照品（Sigma，T1633），奧美拉唑(omeprazole)對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100367-201104），右美沙芬(dextromethorphan)對照品（Sigma，097K11348），內(nèi)標(biāo)吡羅昔康（中國藥品生物制品檢定所，批號：100177-200603），替硝唑（中國藥品生物制品檢定所，批號：100336-200402），甲醇、乙腈為色譜純（Merck Company），二氯甲烷為分析純，實驗用水為超純水.

1.2 儀器

Waters Quattro Micro液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)，色譜工作站：Masslynx 4.0；Mettler AE240電子天平（梅特勒-托利多 (上海)有限公司）；Micro-17R冷凍離心機 (美國 Thermo公司)；Drict-Q5超純水機 (法國Millipore公司)；WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

1.3 動物

雄性 SD大鼠，12只，體重（240±40）g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(浙)2008-0033.

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合探針的配制

稱取甲苯磺丁脲20mg，氯唑沙宗60mg，茶堿25mg，右美沙芬30mg，固體用0.5%CMC-Na研磨混勻后后，全部轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，注射用奧美拉唑鈉粉針劑1支（40mg），用生理鹽水定容.混合探針臨用前配制，現(xiàn)配現(xiàn)用.

2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及質(zhì)控溶液的配制

精密稱取甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶堿、奧美拉唑、右美沙芬各對照品適量，分別溶于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得各對照品儲備液，備用.另精密移取各儲備液適量于同一10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為76.8、112.64、28.672、2.048、1.536μg·mL-1的 混 合對照品儲備溶液.取該混合對照品儲備溶液適量，倍比稀釋成系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷藏于-4℃?zhèn)溆?

吸取上述甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶堿、奧美拉唑、右美沙芬混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，得質(zhì)控高濃度混合標(biāo)液，濃度分別為 38.4、56.32、14.336、1.024、0.768μg·mL-1；質(zhì)控中濃度標(biāo)液，濃度分別為 4.8、7.04、1.792、0.128、0.096μg·mL-1；質(zhì)控中濃度標(biāo)液，濃度分別為 0.3、0.44、0.112、0.008、0.006μg·mL-1，所有標(biāo)液冷藏于-4℃?zhèn)溆?

2.1.3 混合內(nèi)標(biāo)的配制

精密稱取替硝唑和吡羅昔康各對照品適量，分別溶于10mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，得各對照品儲備液.另精密移取各儲備液適量于同一10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，使得替硝唑和吡羅昔康的終濃度分別為1.2、10.6μg·mL-1.冷藏于-4℃冰箱備用.

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB C18(2.1×150mm,5μm)（美國Agilent公司）；保護柱：Agilent EclipaseXDB2C8(2.1mm×12.5mm,5μm)；流動相：乙腈(A)：0.1%甲酸 -4mmol/L甲酸銨(B)=75:25；流速 0.2mL·min-1；進樣量：5μL；柱溫：23℃.

2.3 質(zhì)譜檢測條件

離子化方式為電噴霧 (ESI)；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；正負(fù)離子同時檢測.檢測電壓：3.5kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣體流速：500L·h-1.各成分的檢測離子，質(zhì)核比，錐孔電壓及碰撞氣能量見表1.

表1 5種探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)

2.4 動物給藥方法

12只大鼠隨機平均分為兩組，即實驗組和對照組，實驗組每天上午灌胃清熱養(yǎng)心顆粒4g·kg-1，連續(xù)給藥10天，對照組正常飼養(yǎng).第10天晚上，大鼠禁食不禁水，于第11天早晨兩組大鼠均灌胃給予混合探針?biāo)幬?0mL·kg-1，于給藥前和給藥后5、10、20、40min和 1、1.5、2、2.5、3、5、8、12、24h從 眼底靜脈叢采血約0.4mL，置肝素抗凝試管.全血4000r·min-1離心10min后，吸取上層血漿于-20℃保存待用.整個實驗過程盡量避光.

2.5 大鼠血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品100μL，加入1.3.3項下配制的混合內(nèi)標(biāo)20μl，漩渦30s混勻，加入800μL二氯甲烷，漩渦3min，于4℃，12000r·min-1離心10min，吸取下層有機層 700μl，N2氣吹干，用 75%乙腈 100μL復(fù)溶，12000r·min-1離心 5min，吸取5μL進樣分析.

2.6 數(shù)據(jù)處理

藥動學(xué)參數(shù)采用DAS1.0軟件計算，給藥前后各探針?biāo)巹訉W(xué)參數(shù)的差異用SPSS 11.5統(tǒng)計，以配對t檢驗進行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

3 結(jié)果

3.1 色譜行為

本色譜條件下，甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶堿、奧美拉唑、右美沙芬和內(nèi)標(biāo)替硝唑、吡羅昔康的保留 時 間 分 別 在 2.53、2.42、2.04、2.31、3.26、2.08、2.64min.5種探針?biāo)幬锱c2種內(nèi)標(biāo)分離良好，互不干擾且血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不影響分析物的測定，基線平穩(wěn)（見圖1）.本方法具有良好的特異性和分離度能準(zhǔn)確測定血漿中各探針?biāo)幬锏臐舛?，重現(xiàn)性好.

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取空白血漿100μL，加入2.1.2項下配制的不同濃度的混合標(biāo)液10μL，再加入2.1.3項下混合內(nèi)標(biāo)20μL，按“2.5大鼠血漿樣品處理方法”處理.分別計算各成分的峰面積(Ai)與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積(As)的比值Y，以比值Y對探針?biāo)幬锏倪M樣質(zhì)量濃度進行線性回歸，得回歸方程.見表2.

表2 5種探針?biāo)幬锏木€性關(guān)系及靈敏度考察(μg·mL-1,n=5)

圖1 各分析物及內(nèi)標(biāo)的LC-MS/MS圖譜

3.3 精密度

考察日內(nèi)精密度與日間精密度.取大鼠血漿100μL，分別加入10μL高、中、低質(zhì)控標(biāo)液，每個濃度平行5份，按“2.5血漿樣品處理”方法處理樣品，取5μL進樣分析，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各分析物檢測值，日內(nèi)重復(fù)測定5次，平行測定3天.結(jié)果表明其日內(nèi)和日間精密度均小于10%，準(zhǔn)確度均在90%～115%之間.

3.4 提取回收率

按取大鼠血漿100μL，同上配制高、中、低3個不同濃度含藥血漿質(zhì)控樣品，按“2.5血漿樣品處理方法”處理樣品，記錄分析物峰面積Ax.另以流動相配制相同進樣濃度的含藥溶液，記錄分析物峰面積As.提取回收率計算公式如下：R(%)=Ax/As×8/7×100%，各成分提取回收率（Recoveries）結(jié)果見表3.

3.5 介質(zhì)效應(yīng)

表3 各檢測成分的提取回收率及介質(zhì)效應(yīng)(n=3）

取空白血漿加入800μL二氯甲烷，旋渦振蕩3min,4℃，12000r/min離心10min，吸取下層有機層700μL，N2氣吹干，分別精密加入3個濃度混合質(zhì)控標(biāo)液混合標(biāo)液10μL，再加入2.1.3項下混合內(nèi)標(biāo)20μL，N2氣吹干，用75%乙腈100μL復(fù)溶，12000r/min離心5min，吸取5μL進樣分析，計算介質(zhì)效應(yīng)ME(%).介質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表3.

3.6 樣品穩(wěn)定性考察

考察5種探針?biāo)幬飿?biāo)品及含藥血漿在不同保存條件下的穩(wěn)定性.標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液可在4℃冰箱保存2個月以上.含藥血漿樣品在-40℃冰箱內(nèi)冷凍保存一個月樣品穩(wěn)定.血漿樣品在室溫（避光保存）12h內(nèi)穩(wěn)定.血漿樣品反復(fù)凍融3次后測定，實驗結(jié)果穩(wěn)定.

3.7 藥動學(xué)參數(shù)

3.7.1 5種探針?biāo)幬锏乃?時曲線

實驗組和對照組大鼠分別灌胃混合探針?biāo)幬?，?.5項方法操作，測得5種探針?biāo)幬锏难帩舛?，結(jié)果見圖2.

圖2 5種探針?biāo)幬锝o藥前后的藥-時曲線

3.7.2 6種探針?biāo)幬锏乃巹訉W(xué)參數(shù)

各種成分的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)中國藥理學(xué)會推薦的DAS1.0程序處理，分別按單室、二室、三室模型以最小二乘法擬合，結(jié)果表明甲苯磺丁脲符合一室模型（W=1/CC），其他均符合二室模型（W=1/CC），5種探針?biāo)幬锏纳锇胨テ冢═1/2）、表觀分布容積（Vd/F）、機體總清除率（CL/F）、達峰時間（Tmax）、最大血藥濃度（Cmax）、藥時曲線下面積（AUC）見表4.

表4 5種探針?biāo)幬镌诖笫篌w內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)(±S，n=6)

表4 5種探針?biāo)幬镌诖笫篌w內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)(±S，n=6)

探針 參數(shù) 給藥前 給藥后甲苯磺丁脲 T1/2(h) 5.38±1.21 4.26±0.87 Vd/F(L·kg-1)0.009±0.001 0.007±0.002 Tmax(h) 3.21±0.92 2.82±1.02 Cmax(mg·L-1) 31.61±2.35 27.12±12.a AUC0-t(mg·L-1·h)429.11±41.72 330.67±44.32a AUC0-∞(mg?L-1·h)471.48±42.56 347.30±46.45a氯唑沙宗 T1/2(h) 2.37±0.76 2.04±0.63 Vd/F(L·kg-1) 4.27±1.23 5.41±1.92 CL/F(L·h-1·kg-1)1.49±0.38 2.05±0.74 Tmax(h) 0.67 0.67 Cmax(mg·L-1) 17.93±1.32 12.19±2.03a AUC0-t(mg·L-1·h)45.91±9.81 32.46±10.23 AUC0-∞(mg·L-1·h)46.93±10.76 33.49±11.51

與給藥前比aP<0.05

4 討論

本實驗采用“Cocktail”法考察清熱養(yǎng)心顆粒對大鼠體內(nèi)CYP450酶5種亞型的影響，“Cocktail”方法的建立首先應(yīng)排除同時使用的各種探針底物在體內(nèi)的代謝性相互作用，保持其作用的專屬性；另外為有效評估各種探針底物在給藥前后的藥動學(xué)參數(shù)變化，必須保證每種探針底物有選擇地作用于一種酶，且具有高度敏感性[7-9].在本實驗采用自身對照的方法，將試驗用動物個體間的遺傳代謝性差異降到最低，同時參考文獻[7,10-11]并驗證排除了5種探針?biāo)幬?甲苯磺丁脲、氯唑沙宗、茶堿、奧美拉唑、右美沙芬)在體內(nèi)存在潛在代謝性相互作用的可能性，實驗設(shè)計基本符合“Cocktail”法的條件，因此可以同時給予此5種探針底物以評估艾迪注射液對大鼠體內(nèi)P450酶活性的影響.

由表4可以看出，連續(xù)給予清熱養(yǎng)心顆粒10天后，氯唑沙宗、奧美拉唑和右美沙芬的藥動學(xué)行為無顯著性變化，提示清熱養(yǎng)心顆粒對大鼠CYP2E1、CYP2C19及CYP2D6活性基本無影響；而清熱養(yǎng)心顆粒能使甲苯磺丁脲和茶堿的AUC顯著降低（P<0.05），分別降低至給藥前的0.77和0.60倍，提示艾迪注射液能誘導(dǎo)大鼠CYP2C9和CYP1A2酶的活性.

因此在臨床上使用清熱養(yǎng)心顆粒的同時，合并使用經(jīng)CYP2C9和CYP1A2代謝的藥物，應(yīng)充分考慮兩者合并用藥的給藥劑量對合用藥物代謝的影響，必要時應(yīng)注意調(diào)整合用藥物的給藥劑量，為臨床合理用藥提供依據(jù)，確保臨床療效，同時將可能出現(xiàn)的不良代謝性藥物相互作用降到最低程度.

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