濃縮乳清蛋白粉溶液熒光光譜特性研究

趙 挺

（蚌埠醫(yī)學(xué)院 數(shù)理教研室，安徽 蚌埠 233030）

濃縮乳清蛋白粉是當(dāng)今最為常見(jiàn)的蛋白質(zhì)補(bǔ)充來(lái)源，被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉、運(yùn)動(dòng)員營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑，中老年保健品的生產(chǎn).食品安全與原料質(zhì)量密切相關(guān)，因此加強(qiáng)濃縮乳清蛋白粉的質(zhì)量檢測(cè)十分必要.我國(guó)市場(chǎng)上的濃縮乳清蛋白粉多從外國(guó)進(jìn)口，這使得我們無(wú)法從生產(chǎn)源頭監(jiān)控其質(zhì)量.同時(shí)隨著人們對(duì)乳清蛋白粉日漸追捧，不法商販往往通過(guò)摻假的方式（如加入大豆蛋白，植脂末等），追求暴利.而當(dāng)前檢測(cè)濃縮乳清蛋白粉的方法（見(jiàn)國(guó)標(biāo)GBT11674-2010），大都是化學(xué)方法，其檢驗(yàn)過(guò)程步驟繁瑣，需時(shí)較長(zhǎng)，這就需要找到一種快速有效的檢測(cè)方法.熒光光譜技術(shù)可以快速提供待測(cè)樣品物質(zhì)成分，分子結(jié)構(gòu)以及所處狀態(tài)等大量信息.本文利用熒光光譜技術(shù)，分析濃縮乳清蛋白粉的熒光特性和形成機(jī)理.希望通過(guò)研究，可以為濃縮乳清蛋白粉的質(zhì)量檢測(cè)，提供一定的方法參考和理論依據(jù).

1 濃縮乳清蛋白粉水溶液的三維熒光光譜

我們選擇了3種品牌的進(jìn)口濃縮乳清蛋白粉作為研究對(duì)象.通常人們?cè)谑秤靡詽饪s乳清蛋白粉作為原料的類似食品(如嬰兒配方奶粉等)時(shí)，往往是加水沖調(diào)制成飲料.為了能夠更加接近濃縮乳清蛋白粉的實(shí)際存在環(huán)境，我們以濃縮乳清蛋白粉水溶液作為研究對(duì)象.由于三維熒光光譜法可以同時(shí)記錄被測(cè)量樣本熒光光強(qiáng)與激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的關(guān)系，能夠較全面的反映樣本的熒光特性[1]，為此我們首先檢測(cè)濃縮乳清蛋白粉水溶液的三維熒光光譜.

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

本文所有實(shí)驗(yàn)均采用天津市津維電子儀表有限公司生產(chǎn)的F-450熒光分光光度計(jì).

1.2 樣品制備及實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)樣品為市場(chǎng)上購(gòu)買的三個(gè)品牌的濃縮乳清蛋白粉：

（1）Fonterra濃縮乳清蛋白粉，生產(chǎn)商為新西蘭恒天然集團(tuán).

（2）Glanbia濃縮乳清蛋白粉，生產(chǎn)商為美國(guó)愛(ài)爾蘭哥蘭比亞營(yíng)養(yǎng)有限公司.

（3）Hilmar濃縮乳清蛋白粉，生產(chǎn)商為美國(guó)希爾馬奶酪公司.

這三種蛋白粉中的蛋白質(zhì)含量均標(biāo)稱達(dá)到80%.在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，濃度為1mg/ml的濃縮乳清蛋白粉水溶液的熒光強(qiáng)度最大，故我們以實(shí)驗(yàn)室去離子水為溶劑，分別將樣品配制成濃度為1mg/ml的濃縮乳清蛋白粉水溶液.

實(shí)驗(yàn)中設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)范圍：240nm～310nm.為避免散射光的影響，設(shè)定起始發(fā)射波長(zhǎng)為330nm，以此避開(kāi)一級(jí)散射；設(shè)定最終發(fā)射波長(zhǎng)為460nm，避開(kāi)二級(jí)散射.同時(shí)設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描步距皆為1nm；激發(fā)與發(fā)射的狹縫縫寬均為5nm；掃描速12000nm/min.

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)中分別得到了三個(gè)品牌濃縮乳清蛋白粉水溶液在濃度為1mg/ml時(shí)對(duì)應(yīng)的三維熒光光譜.我們分別采用三維投影圖和等高線圖兩種方式表示出來(lái)，見(jiàn)圖1.

圖1 不同品牌的三維熒光光譜和等高線圖

從圖中可以看出，三種不同品牌的濃縮乳清蛋白粉水溶液熒光光譜的譜峰分布規(guī)律很相似，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)改變時(shí)，發(fā)射峰波長(zhǎng)都是在340nm附近，只是譜峰的強(qiáng)度略有不同，其中Glanbia的強(qiáng)度相對(duì)較大，其他兩個(gè)品牌強(qiáng)度則稍弱，根據(jù)熒光的產(chǎn)生原理，當(dāng)分子從第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷至基態(tài)的任意能級(jí)時(shí)產(chǎn)生熒光，因此熒光的產(chǎn)生和分子被激發(fā)至哪個(gè)能級(jí)無(wú)關(guān)，即發(fā)射峰與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)[1]，所以我們判斷340nm附近的發(fā)射峰應(yīng)是熒光峰.

當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)在240nm到260nm范圍內(nèi)，熒光峰的強(qiáng)度隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增加而變強(qiáng).當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)超過(guò)260nm時(shí)，熒光峰的強(qiáng)度開(kāi)始迅速變大，在300nm附近達(dá)到最大值，之后開(kāi)始減弱，我們推斷激發(fā)峰處于300nm附近.

為了更準(zhǔn)確地確定激發(fā)峰和發(fā)射峰的具體位置，我們又測(cè)量了三個(gè)品牌在發(fā)射光為340nm時(shí)的激發(fā)譜和激發(fā)波長(zhǎng)為280nm時(shí)的發(fā)射譜，如圖2和圖3所示.通過(guò)比較可以看出，3種品牌的濃縮乳清蛋白粉水溶液，激發(fā)譜的范圍主要都在240nm～320nm，激發(fā)峰在298nm處；發(fā)射譜都在300nm～500nm范圍內(nèi)，發(fā)射峰在336nm處.

圖2 不同品牌在發(fā)射光為340nm時(shí)的激發(fā)譜

圖3 不同品牌在激發(fā)光為280nm時(shí)的發(fā)射譜

由此可以確定，三者水溶液的激發(fā)譜和發(fā)射譜雖然強(qiáng)度不同，但變化規(guī)律相似，說(shuō)明三個(gè)品牌的成分幾近相同，所以在下面的實(shí)驗(yàn)中我們將Glanbia濃縮乳清蛋白粉水溶液作為樣本.

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)濃縮乳清蛋白粉的食品成分標(biāo)簽，我們發(fā)現(xiàn)濃縮乳清蛋白粉主要成分為蛋白質(zhì)以及少量的乳糖和脂肪，我們知道蛋白質(zhì)可以發(fā)出內(nèi)源熒光，而色氨酸﹑酪氨酸﹑苯丙氨酸三者的殘基正是這種熒光的主要來(lái)源[2]，處于游離態(tài)時(shí)，這三種熒光生色團(tuán)對(duì)應(yīng)的熒光峰，見(jiàn)表1：

表1 3種生色團(tuán)的熒光特征峰[2]

其中苯丙氨酸熒光效率最低，一般很難發(fā)現(xiàn)其熒光，因此常見(jiàn)的蛋白質(zhì)熒光主要來(lái)自于其他兩種氨基酸殘基，蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基，其熒光特征峰位于313nm[2]；而色氨酸殘基對(duì)所處微環(huán)境的改變十分敏感，其熒光峰在325nm-352nm范圍內(nèi)變動(dòng)[3].在實(shí)驗(yàn)中，三個(gè)品牌的熒光峰都位于336nm處，推測(cè)此熒光峰主要來(lái)自于蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸殘基.

2 不同濃度濃縮乳清蛋白粉水溶液的熒光光譜

不同濃度的濃縮乳清蛋白粉水溶液，其內(nèi)部的熒光團(tuán)所處環(huán)境以及溶液的透光能力都會(huì)有所變化，即溶液熒光特性會(huì)隨著溶液濃度的改變而發(fā)生變化.因此我們又測(cè)量了不同濃度下的發(fā)射譜，確定了濃度與熒光強(qiáng)度，以及熒光峰位置之間的關(guān)系.

2.1 樣品制備及實(shí)驗(yàn)方法

我們利用電子天平稱取濃縮乳清蛋白粉，用少量去離子水溶解后移入容量瓶，分別配制成濃度為0.1mg/ml﹑0.2mg/ml﹑0.4mg/ml﹑0.6mg/ml﹑0.8mg/ml﹑1mg/ml﹑2mg/ml﹑4mg/ml﹑6mg/ml﹑8mg/ml﹑10mg/ml﹑20mg/ml﹑40mg/ml、60mg/ml﹑80mg/ml﹑100mg/ml共 16份樣品，之后用滴管將溶液移入石英皿，測(cè)量相應(yīng)的發(fā)射譜.

根據(jù)上節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們將熒光分光光度計(jì)設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)280nm；發(fā)射波長(zhǎng)范圍：300nm～500nm；步距1nm.激發(fā)和發(fā)射狹縫縫寬和掃描速度設(shè)置與上節(jié)相同.

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 熒光光強(qiáng)與濃度的變化關(guān)系

我們將280nm光激發(fā)的、不同濃度的濃縮乳清蛋白粉水溶液熒光發(fā)射光譜，表示成三維熒光光譜的形式，如圖4所示.從圖中可以看出，隨著濃度不斷增加，溶液熒光強(qiáng)度先變大再變小，溶液濃度超過(guò)40mg/ml后，熒光強(qiáng)度十分微弱.為了便于進(jìn)一步分析，我們將不同濃度段熒光強(qiáng)度的變化情況列于圖5中.

圖4 濃度-發(fā)射三維熒光譜

由圖5-a可以看出，當(dāng)濃縮乳清蛋白粉水溶液濃度在0.1mg/ml～1mg/ml范圍時(shí)，熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，其中在0.1mg/ml～0.4mg/ml時(shí)，熒光強(qiáng)度變化最為迅速，強(qiáng)度擴(kuò)大35倍.根據(jù)熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系有[1]：

當(dāng)溶液濃度很低，公式近似為：

在圖5-a中還可以看出，在0.1mg/ml～0.4mg/ml范圍內(nèi)，由于溶液濃度c較小，此時(shí)熒光強(qiáng)度與溶液濃度之間的關(guān)系符合(1-1)式，即兩者成線性變化趨勢(shì).當(dāng)超過(guò)0.4mg/ml后，由于濃度c較大，此時(shí)熒光強(qiáng)度又符合(1-2)式的規(guī)律，其增加速度趨緩，當(dāng)濃度達(dá)到1mg/ml時(shí)，由于式(1-1)中的e-abc已趨近于零，此時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到了最大值.溶液濃度大于1mg/ml時(shí)，如圖5-a所示，熒光強(qiáng)度開(kāi)始減少，即溶液進(jìn)入熒光淬滅階段，其中在1mg/ml～2mg/ml范圍內(nèi)下降速度變得緩慢.當(dāng)濃度超過(guò)8mg/ml時(shí)，熒光強(qiáng)度又開(kāi)始突然迅速減少，大于40mg/ml時(shí)，如圖5-c所示，溶液熒光強(qiáng)度已十分微弱.

圖5 不同濃度下的發(fā)射譜和濃度-熒光強(qiáng)度曲線

2.2.2 熒光峰與濃度的變化關(guān)系

觀察圖5可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃縮乳清蛋白粉水溶液濃度小于8mg/ml時(shí)，其發(fā)射峰固定在336nm處.濃度超過(guò)8mg/ml之后，熒光峰持續(xù)紅移.為了表示此時(shí)熒光峰位置與溶液濃度之間的關(guān)系，我們給出了圖6，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，在10mg/ml～60mg/ml范圍內(nèi)，熒光峰呈線性的移動(dòng)變化趨勢(shì).

圖6 不同濃度下發(fā)射峰的位置

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在實(shí)驗(yàn)中溶液濃度超過(guò)1mg/ml之后溶液熒光減弱，分析認(rèn)為此現(xiàn)象由以下幾點(diǎn)因素造成：

當(dāng)濃度較高時(shí)，溶液中雜質(zhì)引起的內(nèi)濾效應(yīng)變強(qiáng)，降低了激發(fā)光的強(qiáng)度；其次隨著濃度的增大，位于比色皿前段的熒光物質(zhì)對(duì)于入射光的吸收變強(qiáng)，而中后段的熒光物質(zhì)受到的入射光減弱，使得處于比色皿的中段的的儀器探測(cè)窗口接受到的熒光減弱[1].當(dāng)濃度超過(guò)40mg/m l時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度十分微弱，由于過(guò)渡金屬離子會(huì)與蛋白質(zhì)分子發(fā)生配合作用，產(chǎn)生的配合物往往是不發(fā)光的，此即是過(guò)渡金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)溶液熒光的靜態(tài)猝滅作用[4].表2標(biāo)明了濃縮乳清蛋白粉中主要的礦物質(zhì)含量，從中可看出，雖然經(jīng)過(guò)超濾等工序，但是濃縮乳清蛋白粉仍然存在有鈉，鈣，鉀，鎂，鐵等微量的金屬離子.表2中Fe為過(guò)渡金屬離子[5]，當(dāng)其濃度增大時(shí)，造成了溶液發(fā)生靜態(tài)猝滅.

表2 濃縮乳清蛋白粉中主要離子及其含量

一些金屬離子會(huì)與芳香族配位體產(chǎn)生配合作用，在配位體的配位位置上產(chǎn)生正極化作用，從而使熒光峰紅移[6].根據(jù)上節(jié)實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，濃縮乳清蛋白粉水溶液的熒光主要來(lái)自于蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸殘基，因此我們認(rèn)為當(dāng)溶液濃度增大時(shí)，金屬離子與殘基這種配合作用會(huì)越來(lái)越明顯，從而使得熒光峰不斷紅移.

3 小結(jié)

本文測(cè)量了市場(chǎng)上主要3個(gè)品牌的濃縮乳清蛋白粉水溶液的三維熒光光譜，確定了其激發(fā)峰和發(fā)射峰的位置，之后以Glanbia濃縮乳清蛋白粉水溶液為樣本，測(cè)量了不同濃度下的發(fā)射譜，確定了濃度與熒光強(qiáng)度，以及熒光峰位置之間的關(guān)系，并對(duì)其產(chǎn)生機(jī)理做了分析.通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)：

3.1 三個(gè)品牌的濃縮濃縮乳清蛋白粉水溶液，除強(qiáng)度以外，其三維熒光光譜分布規(guī)律相同，濃度為1mg/ml時(shí)，三個(gè)品牌激發(fā)譜的范圍主要都在240nm到320nm，激發(fā)峰都在298nm處；發(fā)射譜都在300nm到500nm范圍內(nèi)，發(fā)射峰都在336nm處.經(jīng)分析認(rèn)為：濃縮乳清蛋白粉水溶液的發(fā)射峰，主要來(lái)自于蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸殘基.

3.2 280nm光激發(fā)的不同濃度的濃縮乳清蛋白粉水溶液熒光發(fā)射譜，在濃度小于1mg/ml時(shí)熒光強(qiáng)度存在線性增大，之后進(jìn)入了熒光淬滅階段.濃度小于8mg/ml時(shí)，發(fā)射峰均在336nm處，符合熒光發(fā)射特征.濃度超過(guò)8mg/ml之后熒光峰持續(xù)紅移，在10mg/ml-60mg/ml范圍內(nèi)熒光峰的移動(dòng)成線性變化趨勢(shì).我們認(rèn)為含有芳族氨基酸殘基的蛋白質(zhì)與微量金屬離子發(fā)生的配合作用，引起的正極化作用，使得濃度增大時(shí)熒光峰不斷紅移.當(dāng)濃度超過(guò)40mg/ml時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度十分微弱，我們提出這是濃縮乳清蛋白粉溶液中的過(guò)渡金屬離子與蛋白質(zhì)的配合作用，造成溶液發(fā)生靜態(tài)猝滅所致.

〔1〕許金鉤，王尊本.熒光分析法[M].北京:科學(xué)出版社，2007.7-13，154-160.

〔2〕陶慰孫.蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)[M].北京:人民教育出版社，1981.229.

〔3〕王守業(yè)，徐小龍，劉清亮，等.熒光光譜在蛋白質(zhì)分子構(gòu)象研究中的應(yīng)[J].化學(xué)進(jìn)展，2001，13(4):258.

〔4〕黃淑萍，陳亮，李玉紅.比較與研究金屬離子與三種蛋白的配位機(jī)理 [J].光譜學(xué)與光譜分析，1995，15(5):85-87.

〔5〕曹錫章，宋天佑，王杏喬.無(wú)機(jī)化學(xué)[M].北京:高等教育出版社，1994.931-940.

〔6〕陳國(guó)珍，黃賢智，鄭朱梓，許金鉤，王尊本.熒光分析法[M].北京:科學(xué)出版社，1990.108-109.