華山松大小蠹對非寄主揮發(fā)物的觸角電位和行為反應(yīng)

張維平，陳志輝，謝壽安＊，呂淑杰，劉綏鵬，黎 華

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵712100；2.丹鳳縣野生動(dòng)物保護(hù)站，陜西 丹鳳726200；3.國營北川羌族自治縣林場，四川 北川622750）

華山松大小蠹（Dendroctonus armandi Tsai et Li）屬鞘翅目（Coleoptera）、齒小蠹科（Ipidae）、大小蠹屬（Dendroctonus）昆蟲，又名凝脂小蠹，為我國特有種，主要分布于陜西、四川、湖北、甘肅、河南。該蟲主要危害30a以上的華山松健康立木，入侵后引起樹勢急劇衰弱，為其他小蠹及蛀干害蟲入侵奠定了基礎(chǔ)，故屬于秦嶺華山松的先鋒蟲種，是造成我國陜西秦嶺林區(qū)、大巴山南北坡華山松大量枯死的主要原因［1］。

小蠹蟲在與寄主植物長期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了一定的相互關(guān)系，許多小蠹蟲均具有特定的取食習(xí)性，僅攻擊一種或幾種密切相關(guān)的寄主樹木［2-3］，這些寄主樹木廣泛分散在混交林中，時(shí)空上分布不均衡［4］，因此，尋找到正確的生境、寄主樹木并定位適合侵染的寄主個(gè)體是小蠹蟲擴(kuò)散傳播的首要環(huán)節(jié)［5］。

小蠹蟲能夠識別寄主樹木釋放的揮發(fā)性物質(zhì)，作為尋找寄主的嗅覺信號［2］。但與適宜的寄主樹木相比，小蠹蟲在尋找寄主的過程中會遇到更多的不適宜的寄主和非寄主樹木。對樹木的驅(qū)避可能是根據(jù)寄主某些特性的失調(diào)和對非寄主刺激物如非寄主揮發(fā)物的消極反應(yīng)而確定的［6-7］。在遠(yuǎn)處就能識別和回避不適宜的寄主和非寄主，對植食性小蠹減少被捕食和能量損失的風(fēng)險(xiǎn)會是有益的［8-9］。

針葉樹小蠹蟲的寄主和非寄主釋放揮發(fā)性次生化學(xué)物質(zhì)通常是不同的，對于針葉樹，揮發(fā)物主要是單萜，而非寄主被子植物相對釋放大量的六碳的醇、醛和酯類化合物，稱為“綠葉氣體”（green leaf volatiles，GLVs）［10］。張 慶 賀［10-11］等 和 T.M.Poland［12］等發(fā)現(xiàn)非寄主揮發(fā)物中的1-己醇、順-3-己烯-1-醇、3-辛醇和1-辛烯-3-醇可以抑制重齒小蠹（Ips duplicates）和 縱 坑 切 梢 小 蠹 （Tomicus piniperda）的聚集，順-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇和1-己醇能明顯降低二齒星小蠹（Pityogenes bidentatus）對其聚集信息素順式-馬鞭草烯醇和誘殺烯醇的聚集反應(yīng)。目前非寄主揮發(fā)物已經(jīng)在云杉八齒小蠹（Ips typographus）、山松大小蠹（D.ponderosae）、南部松小蠹（D.frontalis）等小蠹蟲的生態(tài)防治中得到了廣泛應(yīng)用［13-15］，而有關(guān)華山松大小蠹對非寄主揮發(fā)物反應(yīng)的研究尚未見報(bào)道。

為探明非寄主揮發(fā)物在華山松大小蠹寄主選擇過程中的作用，研究了華山松大小蠹對其非寄主揮發(fā)物的8種標(biāo)準(zhǔn)化合物的反應(yīng)，篩選其中具有明顯反應(yīng)的化合物，為研制和開發(fā)驅(qū)避劑型，開展華山松大小蠹的綜合治理以及生態(tài)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2014年6月在秦嶺火地塘華山松林內(nèi)（海拔1 915m，33°27'10.0″N，108°28′49.2″E）伐取被華山松大小蠹侵害的華山松，帶回實(shí)驗(yàn)室保存。華山松大小蠹開始羽化后，每日收集單獨(dú)保存，于4℃的冰箱內(nèi)儲存。

1.2 供試化合物

將各樣品配制為液狀石蠟溶液，以0.01～100（以10倍遞增）進(jìn)行劑量反應(yīng)測試。所用樣品的名稱、純度及來源見表1。

表1 8種供試化合物的名稱、純度及來源Table 1 Name，purity and source of 8standard chemical compounds

1.3 觸角電位測定

用解剖刀將華山松大小蠹觸角自基部切下，用Spectra 360導(dǎo)電膠將其固定在PR（Gain10×10）電極上，氣味管末端與觸角之間的距離約1cm。用微量取樣器抽取10μL樣品溶液，均勻地滴在2cm×0.5cm的濾紙條上，放入10cm長的樣品管中，樣品管末端連接氣體刺激控制裝置，其通有持續(xù)性濕潤氣流（40mL·min-1），刺激氣流流速為20mL·min-1。待基線穩(wěn)定后給予刺激，每次刺激時(shí)間為0.5s，刺激間隔至少30s，以保證觸角感受能夠完全恢復(fù)，每只待測小蠹蟲只用一根觸角。試驗(yàn)每處理測試觸角8根，每樣品平均刺激5次。選用1μg·μL-1的順-3-己烯-1-醇作為對照，因?yàn)轫?3-己烯-1-醇是植物中常見的綠葉氣味，在昆蟲與植物關(guān)系中具有重要作用［16］，常被選為昆蟲觸角電位反應(yīng)的測試標(biāo)樣［17-19］，且已證明對多種小蠹蟲具有反應(yīng)活性［19-20］。相同樣品按濃度自低向高進(jìn)行測定。將每一樣品觀測值除以前后2次對照測定值的平均值即得該樣品的觸角電位反應(yīng)相對值。

1.4 行為反應(yīng)測定

采用Y型嗅覺儀測定華山松大小蠹成蟲對8種非寄主揮發(fā)物的行為反應(yīng)。Y型嗅覺儀主臂長15cm，兩側(cè)臂長10cm，側(cè)臂間夾角為75°，主臂和側(cè)臂內(nèi)徑均1.5cm。兩側(cè)臂分別用硅膠管與500 mL錐形瓶相連。錐形瓶中放置含有待測樣品的2 mL樣品瓶，錐形瓶用硅膠管依次與流量計(jì)和加濕瓶相連?？諝饬魉僬{(diào)節(jié)為0.5～0.6L·min-1；測量時(shí)間為8：00-18：00；測量溫度為25℃±1℃。測量時(shí)將華山松大小蠹由Y型管主臂管口引入，如果試蟲進(jìn)入氣味源的支管并爬過分支臂的連接處的距離超過5cm，記作華山松大小蠹對該處理臂做出了選擇，即對該處理具有趨向反應(yīng)，否則記為對該氣味無選擇。每測5頭將Y型管2分支臂對調(diào)，每個(gè)處理測量完成后更換Y型管和錐形瓶，用酒精徹底清洗，自然晾干。每種樣品只測試1、10、100μg·μL-13種較高濃度下的行為反應(yīng)，每組測試的個(gè)體數(shù)達(dá)30頭，重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan多重分析法比較華山松大小蠹成蟲對8種揮發(fā)物行為反應(yīng)和觸角電位反應(yīng)的差異。利用T檢驗(yàn)分析比較雌蟲和雄蟲觸角電位反應(yīng)之間的差異。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Sigmaplot 12.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對不同非寄主揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)

從表2可以看出，在100μg·μL-1濃度下，順-2-己烯-1-醇引起華山松大小蠹雌蟲的觸角電位反應(yīng)最強(qiáng)，與其他7種揮發(fā)物達(dá)到顯著性差異水平（p＜0.05），順-3-己烯-1-醇次之，1-辛烯-3-醇引起的觸角電位反應(yīng)最弱。華山松大小蠹雄蟲對順-3-己烯-1-醇的觸角電位反應(yīng)最強(qiáng)，并與其他7種揮發(fā)物達(dá)到極顯著性差異水平（p＜0.01），其次為順-2-己烯-1-醇和苯甲醛，與其余揮發(fā)物具有顯著性差異，3-辛醇和1-辛烯-3-醇引起的華山松大小蠹雄蟲的觸角電位反應(yīng)最弱。T檢驗(yàn)表明，華山松大小蠹成蟲對8種揮發(fā)物（100μg·μL-1）的觸角電位反應(yīng)不存在性別差異。

表2 華山松大小蠹成蟲對非寄主揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)Table 2 Electroantennographic responses of adult D.armandi to nonhost volatiles 100μg·μL-1

2.2 對不同濃度非寄主揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)

由圖1可知，所選擇的8種非寄主揮發(fā)物在特定的濃度下均能引起華山松大小蠹雌雄蟲一定的觸角電位反應(yīng)。8種非寄主揮發(fā)物的劑量反應(yīng)均表現(xiàn)出相同的規(guī)律：隨著揮發(fā)性化合物濃度的升高，觸角電位反應(yīng)值增大，最大值均出現(xiàn)在100μg·μL-1濃度。在0.01μg·μL-1和0.1μg·μL-1濃度下，反式-2-己烯-1-醇和3-辛醇引起華山松大小蠹雌雄蟲的觸角電位反應(yīng)較強(qiáng)；在10μg·μL-1和100μg·μL-1濃度下，雌雄蟲對順-2-己烯-1-醇和順-3-己烯-1-醇的觸角電位反應(yīng)較強(qiáng)，對1-辛烯-3-醇和3-辛醇的觸角電位反應(yīng)較弱。T檢驗(yàn)表明，在0.01、0.1、1、10μg·μL-1濃度下，華山松大小蠹對非寄主揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)仍不存在性別差異。

2.3 對8種非寄主揮發(fā)物的室內(nèi)趨向反應(yīng)

由圖2可知，室內(nèi)趨向反應(yīng)表明，除順-3-己烯-1-醇和反-2-己烯-1-醇驅(qū)避反應(yīng)不明顯外，華山松大小蠹對其余6種非寄主揮發(fā)物均表現(xiàn)出不同程度的驅(qū)避作用，隨著揮發(fā)物濃度的增加，揮發(fā)物的驅(qū)避作用增強(qiáng)。在1μg·μL-1濃度下，3-辛醇與其他揮發(fā)物相比呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），表現(xiàn)出明顯的驅(qū)避作用，正趨向率低于30%；順-3-己烯-1-醇、1-己烯-3-醇和1-辛烯-3-醇三者之間沒有顯著性差異，但與順-2-己烯-1-醇和反-2-己烯-1-醇具有顯著性差異，表現(xiàn)出較弱的驅(qū)避作用，正趨向率低于40%。在10μg·μL-1濃度下，順-3-己烯-1-醇、1-己烯-3-醇、苯甲醛和反-2-己烯醛的驅(qū)避作用增強(qiáng)；1-辛烯-3-醇驅(qū)避作用明顯增強(qiáng)。在100μg·μL-1濃度下，除順-2-己烯-1-醇和反-2-己烯-1-醇以外，其他6種揮發(fā)物均能引起華山松大小蠹成蟲明顯的驅(qū)避反應(yīng)，正趨向率低于30%，并且揮發(fā)物之間沒有顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

圖1 華山松大小蠹雌雄蟲對8種非寄主揮發(fā)物不同濃度的觸角電位反應(yīng)Fig.1 Electroantennographic responses of D.armandi to different concentrations of eight nonhost volatiles

非寄主揮發(fā)物在小蠹蟲的寄主選擇過程中擔(dān)當(dāng)重要的角色，目前已發(fā)現(xiàn)十幾種小蠹蟲對非寄主揮發(fā)物具有反應(yīng)［11］。本研究測定的8種非寄主揮發(fā)物在特定濃度下均引起華山松大小蠹的觸角電位反應(yīng)。華山松大小蠹對非寄主揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)不具有性別差異，這與之前對小蠹蟲非寄主揮發(fā)物的研究結(jié)果一致［11，20］。此外，華山松大小蠹對8種非寄主揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)值隨濃度的升高而增強(qiáng)，與華山松大小蠹對寄主揮發(fā)物的反應(yīng)有差異，高濃度的寄主揮發(fā)物會抑制其EAG反應(yīng)［21-22］，這說明華山松大小蠹對非寄主揮發(fā)物與寄主揮發(fā)物的反應(yīng)機(jī)制可能存在差異。華山松大小蠹對反-2-己烯-1-醇、反-2-己烯醛、1-辛烯-3-醇和3-辛醇的觸角電位反應(yīng)雖有一定的差異，但是差異并不極顯著（p＞0.01），表明華山松大小蠹對多種非寄主揮發(fā)物的反應(yīng)具有相似性，這可能是因?yàn)樵谛◇枷x寄主搜尋的過程中，非寄主揮發(fā)物作為一類化學(xué)信息物質(zhì)是在生境水平上發(fā)揮驅(qū)避作用，所以小蠹蟲需要識別并避開非寄主闊葉樹普遍釋放的揮發(fā)物，而不是針對某種非寄主的特定揮發(fā)物［23］。室內(nèi)趨向反應(yīng)表明，測定的揮發(fā)物中順-3-己烯-1-醇、1-辛烯-3-醇、3-辛醇、1-己烯-3-醇、苯甲醛和反-2-己烯醛在一定濃度下對華山松大小蠹成蟲表現(xiàn)出明顯的驅(qū)避作用，說明華山松大小蠹在寄主選擇過程中可能會避開產(chǎn)生該類物質(zhì)的非寄主樹木。3-辛醇引起華山松大小蠹的觸角電位反應(yīng)最弱，但其對華山松大小蠹驅(qū)避作用最強(qiáng)，這可能是因?yàn)橛|角電位反應(yīng)只是觸角感覺器官的參與，不能代表整個(gè)有機(jī)體的復(fù)雜系統(tǒng)［24］，此外小蠹蟲對非寄主揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)和行為反應(yīng)二者之間的關(guān)系也具有復(fù)雜性，觸角電位反應(yīng)值與驅(qū)避作用并不是單純的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。

對于小蠹蟲寄主選擇過程的研究是開發(fā)信息化合物防控小蠹蟲技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，近年來，通過對寄主華山松的揮發(fā)物的篩選，已經(jīng)明確了α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、3-蒈烯等對華山松大小蠹的引誘效果，并已初步應(yīng)用于野外防治［25-27］。將非寄主揮發(fā)物作為驅(qū)避劑與寄主揮發(fā)物或者性信息素結(jié)合應(yīng)用的“推-拉”策略要優(yōu)于單純用引誘劑（“拉”）的效果，有助于推動(dòng)小蠹蟲綜合管理水平的提高。

圖2 華山松大小蠹成蟲對非寄主揮發(fā)物的行為反應(yīng)Fig.2 Behavioral responses of D.armandi to nonhost volatiles

本試驗(yàn)測定了華山松大小蠹對幾種非寄主揮發(fā)物的電生理反應(yīng)及室內(nèi)趨向反應(yīng)，表明順-3-己烯-1-醇、1-辛烯-3-醇、3-辛醇、1-己烯-3-醇、苯甲醛和反-2-己烯醛對其有較強(qiáng)的驅(qū)避作用，其中3-辛醇的驅(qū)避作用最強(qiáng)，說明利用這5種化合物可能配制出有效的驅(qū)避劑，但是否可以達(dá)到理想林間引誘效果及應(yīng)如何配比還待進(jìn)一步研究。此外，這幾種化合物對華山松大小蠹聚集信息素及寄主揮發(fā)物的抑制作用是否存在，有待于通過進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

［1］ 李成德.森林昆蟲學(xué)［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2004.

［2］ WOOD D L.The role of pheromones，kairomones and allomones in the host selection and colonization of bark beetles［J］.Annu Rev.Entomol，1982，27：411-446.

［3］ KELLEY S T，F(xiàn)ARRELL B D.Is specialization a dead end？The phylogeny of host use in Dendroctonus bark beetles（Scolytidae）［J］.Evolution，1998，52：1731-1743.

［4］ SEQUEIRA A S，NORMARK B B，F(xiàn)ARRELL B D.Evolutionary assembly of the conifer fauna：distinguishing ancient from recent association in bark beetles［J］.Proceedings of the Royal Society Biological Series B，2000，267：2359-2366.

［5］ RAFFA K F，BENYMAN A A.Interacting selective pressures in conifer bark beetle systems：a basis for reciprocal adaptations［J］.American Naturalist，1987，129：234-262

［6］ HRDY I.Insect chemical ecology［M］.Prague：Acadamia Payne，1991：277-280.

［7］ SCHROEDER L M.Olfactory recognition of nonhosts aspen and birch by conifer bark beetles Tomicus piniperda and Hy lurgops palliates［J］.J.Chem.Ecol.，1992，18：1583-1593.

［8］ MITTON J B，STURGEON K B.Bark beetles in North American conifers：A system for the study of evolutionary biology［M］.Austin：University of Texas Press，1982：140-182.

［9］ ATKINS M D.Lipid loss with flight in the douglas-fir beetle［J］.The Canadian Entomologist，1969，101（2）：164-165.

［10］ ZHANG Q H，SCHLYTER F.Olfactory recognition and behavioural avoidance of angiosperm nonhost volatiles by conifer-inhabiting bark beetles［J］.Agricultural and Forest Entomology，2004，6（1）：1-19.

［11］ ZHANG Q H，LIU G T.Olfactory responses of Ips duplicatus from Inner Mongolia，China to nonhost leaf and bark volatiles［J］.Journal of Chemical Ecology，2001，27（5）：995-1009.

［12］ POLAND T M，DEGROOT P，BURKE S，et al.Semiochemical disruption of the Pine Shoot Beetle，Tomicus piniperda （Coleoptera：Scolytidae）［J］.Environmental Entomology，2004，33（2）：221-226.

［13］ UNELIU CR，SCHIEBE C，BOHMAN B.Non-host volatile blend optimization for forest protection against the Eurpean Spruce bark beetle，Ips typographus［J］.Plos One，2014，9（1）：1-10.

［14］ WILLIAM PS，BRIAN TS.Southern Pine Beetle，Dendroctonus frontalis，antennal and behavioral responses to nonhost leaf and bark volatiles［J］.J.Chem.Ecol.，2014，39：481-493.

［15］ PROGAR R A，GILLETTE N，F(xiàn)ETTIG C J.Applied chemical ecology of the mountain pine beetle［J］.FOREST SCIENCE.2014，60（3）：414-433.

［16］ WEI J N，KANG L.Roles of（Z）-3-hexenol in plant-insect interactions［J］.Plant Signaling &Behavior，2011，6（3）：369-371.

［17］ 李建光，駱有慶.復(fù)葉槭揮發(fā)性物質(zhì)對光肩星天牛的觸角電位反應(yīng)［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21（4）：1-5.LI J G，LUO Y Q.Electroantennogram activity of ash-leaf maple（Acer negundo）volatiles to Anoplophora glabripennis（Motsch.）［J］.Journal of Beijing Forestry University，1999，21（4）：1-5.（in Chinese）

［18］ 李為爭，楊雷，申小衛(wèi).金龜甲對蓖麻葉揮發(fā)物的觸角電位和行為反應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，33（21）：6895-6903.LI W Z，YANG L，SHEN X W.Electroantennographic and behavioural responses of scarab beetles to Ricinus communis leaf volatiles［J］.Acta Ecologica Sinica，2013，33（21）：6895-6903.（in Chinese）

［19］ 周琦.非寄主植物揮發(fā)物對云杉八齒小蠹危害行為的干擾［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2011.

［20］ ZHANG L W，NANCY E.Gillette.Electrophysiological and behavioral responses of Dendroctonus valens to non-host volatiles［J］.Annals of Forest Science，2007，64（3）：267-273.

［21］ ZHANG L L，CHEN H，MA C.Electrophysiological responses of Dendroctonus armandi（Coleoptera：Curculionidae：Scolytinae）to volatiles of Chinese white pine as well as to pure enantiomers and racemates of some monoterpenes［J］.Chemoecology，2010，20：265-275.

［22］ 王茹琳，楊 偉，楊佐忠.華山松大小蠹對幾種寄主揮發(fā)物組分的EAG 和行為反應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2011，30（4）：724-729.WANG R L，YANG W，YANG Z Z.Electroantennographic and behavioral responses of Dendroctonus armandi（Tsai et Li）to host plant volatiles［J］.Chinese Journal of Ecology，2011，30（4）：724-729.（in Chinese）

［23］ REDDY G V P，GUERRERO A.Interactions of insect pheromones and plant semiochemicals［J］.Trends in Plant Science，2004，9（5）：253-261.

［24］ 黃恩烱.8種昆蟲對蓖麻毒素和相思豆毒素觸角電位及行為反應(yīng)的研究［D］.北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2008.

［25］ 吳紹平，陳輝，吳瓊.華山松大小蠹成蟲糞便揮發(fā)性物質(zhì)分析［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，27（2）：111-116.WU S P，CHEN H，WU Q.Volatile compounds in the frass of adult Chinese white pine beetle［J］.Journal of Northwest Forestry University，2012，27（2）：111-116.（in Chinese）

［26］ 趙明振，陳輝，馬超.華山松大小蠹對華山松揮發(fā)性物質(zhì)行為反應(yīng)的研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30（5）：115-119.ZHAO M Z，CHEN H，MA C.Behavioral responses of Dendroctonus armandi （Coleoptera：Curculionidae：Scolytinae）to volatiles of Chinese White Pine［J］.Journal of Northwest Forestry University，2014，30（5）：115-119.（in Chinese）

［27］ XIE S A，LV S J.An improved lure for trapping the bark beetle Dendroctonus armandi （Coleoptera：Scolytinae）［J］.Eur.J.Entomol，2012，109：569-577.