重度子癇前期患者外周血中性粒細胞表面黏附分子LFA-1水平變化的研究

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

重度子癇前期患者外周血中性粒細胞表面黏附分子LFA-1水平變化的研究

魏軍，王煒，唐歡，吳曉竹，劉彩霞

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

目的通過檢測重度子癇前期孕婦及正常孕婦外周血中性粒細胞計數(shù)及中性粒細胞表面黏附分子淋巴細胞功能相關(guān)抗原1（LFA-1）的表達水平，探討中性粒細胞活化與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。方法選擇2013年11月至2014年2月于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科就診的孕產(chǎn)婦28例，分為重度子癇前期組（n=14）和對照組（同期正常妊娠婦女，n=14）。2組孕產(chǎn)婦年齡、孕周無統(tǒng)計學差異。采用流式細胞術(shù)檢測2組孕產(chǎn)婦外周血中性粒細胞表面黏附分子LFA-1的表達情況。檢測重度子癇前期組患者平均動脈壓，對其與中性粒細胞表面LFA-1表達水平進行相關(guān)性分析。結(jié)果重度子癇前期組外周血中性粒細胞計數(shù)［（8.40±2.23）×109/L］明顯高于正常妊娠組［（6.71±1.58）×109/L］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。重度子癇前期組外周血中性粒細胞表面黏附分子LFA-1表達陽性率［（63.25±38.025）%］明顯高于正常妊娠組［（38.32±38.65）%］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。重度子癇前期患者外周血中性粒細胞表面LFA-1表達水平與平均動脈壓呈顯著正相關(guān)（r=0.64，P=0.013）。結(jié)論重度子癇前期患者外周血中性粒細胞計數(shù)及其表面黏附分子LFA-1表達均較正常妊娠婦女明顯升高，且與病情嚴重程度顯著相關(guān)，提示中性粒細胞的活化參與了子癇前期發(fā)病。

子癇前期；中性粒細胞；淋巴細胞功能相關(guān)抗原1

子癇前期（preeclampsia，PE）是懷孕前血壓正常的孕婦于妊娠20周以后出現(xiàn)的以高血壓、蛋白尿等為主要臨床癥狀的一種疾病，發(fā)病率高達8%，常伴有嚴重的母嬰并發(fā)癥，是導致孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的重要原因之一［1］。PE病因?qū)W及發(fā)病機制尚未完全清楚，包括遺傳傾向、免疫應(yīng)答及過度的炎性反應(yīng)等均有可能導致這種妊娠疾病的發(fā)展，由于發(fā)病原因不清，多年來一直缺乏理想的治療手段。探尋其發(fā)病機制，阻斷發(fā)病環(huán)節(jié)，從而進行防治是產(chǎn)科的研究熱點。

近年的研究認為，機體的過度炎性反應(yīng)在PE的發(fā)病過程中起顯著作用［2］，中性粒細胞的激活被認為是導致PE患者過度炎性反應(yīng)的主要原因［3］。中性粒細胞表面黏附分子淋巴細胞功能相關(guān)抗原1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）屬β2家族整合蛋白，有α鏈（CD11a）和β鏈（CD18）2個亞單位，由非共價鍵連接成異二聚體［4］。它能夠介導細胞間黏附反應(yīng)，黏附分子的表達越高，表明中性粒細胞黏附到內(nèi)皮細胞上并被激活的程度越高。

目前，對PE患者外周血中中性粒細胞表面黏附分子LFA-1的研究較少。本研究擬檢測外周血正常孕產(chǎn)婦及PE重度孕產(chǎn)婦的中性粒細胞計數(shù)，并應(yīng)用流式細胞學分析技術(shù)檢測PE患者外周血中性粒細胞表面黏附分子LFA-1的變化，探討中性粒細胞的活化與PE發(fā)病的關(guān)系，進一步為PE的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)，從而為尋找防治措施提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2013年11月至2014年2月于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科就診的孕婦28例，將其分為對照組和重度PE組，每組各14例。重度PE組平均年齡（28.4±1.28）歲，孕周為（36.0±0.56）周；對照組為同期正常妊娠婦女，平均年齡（29.3±0.86）歲，孕周為（36.6±0.64）周。2組孕產(chǎn)婦年齡、孕周無統(tǒng)計學差異，均無內(nèi)科合并癥及其他產(chǎn)科并發(fā)癥，未服用免疫抑制或增強藥物。重度PE診斷及分類標準依據(jù)樂杰主編的第7版《婦產(chǎn)科學》［5］。所有研究對象均知情同意。治療前空腹采取肘靜脈血6 mL，置于EDTA防凝管保存，4 h內(nèi)送檢。采血后立即測定平均動脈壓。

主要儀器及試劑：全自動血細胞分析儀（cd-1700型，美國雅培公司）；流式細胞儀（FACSCalibur，美國BD公司）。CD11a-PE（美國BD Bioscience Immunocytometry Systems）；中性粒細胞分離液及紅細胞裂解液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（盛京醫(yī)院中心實驗室提供）。

1.2 方法

1.2.1 中性粒細胞計數(shù)：應(yīng)用全自動血細胞分析儀行血常規(guī)檢測，記錄中性粒細胞計數(shù)值。

1.2.2 中性粒細胞表面LFA-1檢測

1.2.2.1 外周血中性粒細胞的分離 在離心管中加入2 mL中性粒細胞分離液，取EDTA抗凝靜脈血1 mL，等量PBS稀釋后，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。常溫下水平離心1 500 r/min×25 min。離心后管內(nèi)分為4層：第一層為血漿層；第二層為環(huán)狀乳白色的單個核細胞層；第三層為略帶混濁的分離液層（富集一定量的中性粒細胞）；第四層為紅細胞層。收集第三層分離液層和第四層紅細胞層，放入含5倍體積的PBS試管中，常溫下水平離心1 800 r/min×30 min。棄上清，取沉淀，經(jīng)1次洗滌后用紅細胞裂解液裂解紅細胞，再經(jīng)3次洗滌去除紅細胞內(nèi)容物和碎片，留取沉淀細胞即為中性粒細胞。加入PBS 1 mL，重懸細胞，備用。

1.2.2.2 中性粒細胞表面LFA-1（CD11a）的檢測每份標本設(shè)實驗管及陰性對照管2個試管。實驗管中加入抗體CD11a-PE 20 μL，對照管中加入PBS 20 μL。向每管中加入提取的中性粒細胞懸液50 μL，加樣完畢后，震蕩混勻，避光靜置30 min。各試管中依次加入400 μL PBS，吹打重懸，上機檢測。先測定陰性對照管，設(shè)門，確定工作條件，再測定實驗管。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包對計量資料LFA-1表達陽性率進行非參數(shù)秩和檢驗，對計量資料中性粒細胞計數(shù)行t檢驗。重度PE患者外周血中性粒細胞表面LFA-1表達與平均動脈壓進行Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重度PE組與正常妊娠組中性粒細胞計數(shù)的比較

外周血中性粒細胞計數(shù)結(jié)果顯示：重度子癇前期組［（8.40±2.23）×109/L］明顯高于正常妊娠組［（6.71±1.58）×109/L］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 重度PE組與正常妊娠組中中性粒細胞表面LFA-1（CD11a）表達率的比較

結(jié)果顯示：重度PE組外周血中性粒細胞表面黏附分子LFA-1表達陽性率［（63.25±38.025）%］明顯高于正常妊娠組［（38.32±38.65）%］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CD11a+中性粒細胞在重度PE組的陽性率高于正常晚期妊娠組，兩者間有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）。

2.3 重度PE患者外周血中性粒細胞表面LFA-1表達水平與平均動脈壓相關(guān)性分析

圖1 重度PE組與對照組中性粒細胞表面LFA-1（CD11a）表達率的比較Fig.1 Expression of LFA-1（CD11a）in neutrophils in the severe preeclamptic group and the control group

統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示：重度PE患者外周血中性粒細胞表面LFA-1表達與平均動脈壓呈顯著正相關(guān)（r=0.64，P=0.013）。見圖2。

圖2 重度子癇前期患者外周血中性粒細胞LFA-1表達水平與平均動脈壓的相關(guān)性Fig.2 The correlation of LFA-1 expression on neutrophil with mean blood pressure in severe preeclamptic patients

3 討論

PE是臨床上常見的、嚴重威脅母嬰健康的妊娠期特有疾病，但由于其發(fā)病機制至今尚不明確，嚴重影響了有效防治。近年來的研究普遍認為PE是母體對妊娠的一種過度炎性介質(zhì)反應(yīng)［6］，PE患者存在母體全身性的血管內(nèi)炎性反應(yīng)激活，炎性反應(yīng)引起內(nèi)皮細胞損傷和功能紊亂，可導致高血壓、蛋白尿、水腫等一系列PE相關(guān)的臨床表現(xiàn)。

中性粒細胞是體內(nèi)數(shù)量最多的炎性細胞，其活化或抑制對炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起重要作用。在生理情況下，妊娠后期及分娩時中性粒細胞增多，被認為是炎性反應(yīng)的證據(jù)。中性粒細胞計數(shù)可能代表疾病過程中炎性反應(yīng)的嚴重程度。本研究中，重度PE患者中性粒細胞計數(shù)較正常孕產(chǎn)婦顯著增多，提示PE與過度炎性反應(yīng)有關(guān)。Canzoneri等［7］的研究表明，PE患者白細胞計數(shù)較正常妊娠患者顯著增加，但單核細胞及淋巴細胞增加不明顯，與本研究結(jié)果一致。

過多的細胞毒性物質(zhì)和炎性介質(zhì)可引起血管內(nèi)皮損傷。當血管內(nèi)皮細胞受損時血管內(nèi)皮源性舒張因子、一氧化氮、血管舒張因子前列環(huán)素分泌減少，血管內(nèi)皮收縮因子血栓素A2產(chǎn)生增加，導致收縮因子和舒張因子比例失調(diào)，致使血壓升高，從而導致PE一系列病理變化；而全身小血管痙攣、各系統(tǒng)、臟器灌流減少可導致組織相對缺氧，促進骨髓白細胞貯備池進一步釋放增加。血循環(huán)中中性粒細胞數(shù)量增高，激活程度越高，被誘導產(chǎn)生超氧化陰離子，使脂質(zhì)過氧化，發(fā)揮其殺傷和吞噬異物的作用就越大，則損傷內(nèi)皮細胞的可能越大。

中性粒細胞的激活涉及細胞黏附和穿過內(nèi)皮細胞的病理生理過程，其中最重要的是內(nèi)皮細胞表面黏附分子和中性粒細胞表面受體的相互作用［8］。中性粒細胞黏附到內(nèi)皮細胞需要內(nèi)皮細胞和中性粒細胞表面黏附分子的激活和表達。LFA-1屬于β2家族整合蛋白，有α鏈（CD11a）和β鏈（CD18）2個亞單位，由非共價鍵連接成異二聚體。研究表明，二價的LFA-1二聚體是有效結(jié)合ICAM-1的最小結(jié)構(gòu)。中性粒細胞表面的黏附分子LFA-1通過與血管內(nèi)皮細胞上ICAM-1的有效結(jié)合，可導致血流剪切作用下內(nèi)皮細胞-白細胞間的聚集和（或）黏附［9］，進而導致中性粒細胞的過度活化，促進炎性反應(yīng)病理生理過程的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PE患者中性粒細胞表面黏附分子LFA-1表達陽性率較正常妊娠婦女明顯增加，且中性粒細胞表面LFA-1表達水平與平均動脈壓呈顯著正相關(guān)，提示PE患者外周血中中性粒細胞的活化程度增高，炎性反應(yīng)程度升高，并與PE的嚴重程度有關(guān)。

高表達的LFA-1與其配體ICAM-1結(jié)合，導致中性粒細胞的過度活化。中性粒細胞被激活，在炎性區(qū)域產(chǎn)生并釋放出一系列胞漿內(nèi)容物，如彈性蛋白酶、髓過氧化物酶、溶菌酶等，并且可以產(chǎn)生IL-1、IL -6、IL-8、TNF等趨化因子和損傷因子使內(nèi)皮細胞進一步損傷［10，11］，使血管痙攣和通透性增加，導致PE的水腫、蛋白尿、高血壓等臨床表現(xiàn)的產(chǎn)生。且這些損傷因子又可趨化中性粒細胞向受損血管內(nèi)皮區(qū)域游走，增加中性粒細胞計數(shù)，誘導中性粒細胞活化。最近有研究表明，這些趨化因子也可以激活LFA-1，使得中性粒細胞更緊密地黏附到內(nèi)皮細胞，進一步加重血管內(nèi)皮損傷，導致惡性循環(huán)。Kollum等［12］利用抗ICAM-1 mAb作為一種抗炎治療方案應(yīng)用于缺血再灌注損傷的治療，結(jié)果表明其對血管內(nèi)皮細胞的損傷具有明顯抑制作用，可能因其抑制了ICAM-1與LFA-1的黏附，從而抑制了中性粒細胞的活化。這也為PE的預(yù)防及治療提供了一條新的思路。

總之，中性粒細胞的過度活化與PE的發(fā)生機制有關(guān)，隨著研究的深入，抑制中性粒細胞的過度活化有可能成為妊高癥預(yù)防及治療的新途徑。

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（編輯王又冬）

Study on Changesof LFA-1 Levelin PeripheralNeutrophilsin Patientswith Severe Preeclampsia

WEIJun，WANGWei，TANGHuan，WU Xiao-zhu，LIU Cai-xia

（DepartmentofGynecology and Obstetrics，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

Objective To check the neutrophilcountand the expression ofcellsurface adhesion molecule，lymphocyte function associated antigen-1（LFA-1）in peripheral neutrophils in severe preeclamptic patients and normal pregnant women in order to investigate the correlation of neutrophil activation with preeclampsia.MethodsTotally 28 pregnant women in the department of gynecology and obstetrics in Shengjing Hospital from November 2013 to January 2014 were included in the study，and divided into the severe preeclampsia group（n=14），and the control group（normal pregnantwomen，n=14）.There was no statistically significantdifference in age and gestationalweeksbetween the two groups.The expression ofLFA -1 in peripheral neutrophils was detected by flow cytometry in the two groups.Mean blood pressure（MBP）was measured in the severe preeclamptic group，and the correlation of MBP with expression of LFA-1 was analyzed.ResultsThe neutrophil count was 8.40±2.23×109/L in the severe preeclamptic group，significantly higher than（6.71±1.58）×109/L in the control group，（P＜0.05）.The positive rate of LFA-1 in peripheral neutrophils was 63.25±38.025%in the severe preeclamptic patients，significantly higherthan 8.32±38.65%in the controlgroup（P＜0.05）.The expression level of LFA-1 in peripheral neutrophils was significantly correlated with mean blood pressure in severe preeclamptic patients（r=0.64，P=0.013）.ConclusionThe neutrophil count and the expression of LFA-1 in peripheral neutrophils were significantly increased in severe preeclamptic patients compared to normalpregnantwomen，and significantly correlated with severity ofpreeclampsia，suggesting thatneutrophilactivation participated in the pathogenesisofpreeclampsia.

preeclampsia；neutrophils；lymphocyte function associated antigen-1

R714.24+4

A

0258-4646（2015）03-0263-04

魏軍（1968-），女，副教授，博士. E-mail：weij@sj-hospital.org

2014-11-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：