超濾技術(shù)去除羥基喜樹堿中細菌內(nèi)毒素的研究

【摘 要】本實驗采用超濾技術(shù)去除羥基喜樹堿中的細菌內(nèi)毒素。超濾后有效成分透過率為96.2%。超濾后細菌內(nèi)毒素的去除效果：細菌內(nèi)毒素去除率為96.0%。實驗結(jié)果表明此方法可用于羥基喜樹堿中細菌內(nèi)毒素的去除。

【關(guān)鍵詞】超濾技術(shù)；羥基喜樹堿；研究

羥基喜樹堿是從我國特有的珙垌科喬木―喜樹中分離提取的一種微量生物堿。羥基喜樹堿抗癌機制獨特，通過選擇性的抑制拓撲異構(gòu)酶I而干擾DNA的復(fù)制，具有高效低毒、廣譜抗癌的特點，與其它常用抗腫瘤藥物無交叉耐藥性，對多種抗藥性腫瘤仍然有效[1-2]。羥基喜樹堿是目前從喜樹中分離的20多個單體中抗癌作用最強的化合物。羥基喜樹堿臨床用于膀胱癌、直腸癌、肝癌、白血病及頭頸部腫瘤等[3-9]。超濾技術(shù)是通過膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對物質(zhì)進行選擇性分離，從而實現(xiàn)大、小分子的分離、濃縮、凈化的目的。超濾技術(shù)具有濾過程是在常溫下進行，條件溫和無成分破壞；濾過程不發(fā)生相變化；能耗低；超濾技術(shù)分離效率高；流程短；操作簡便；易于控制和維護等特點。本實驗采用超濾技術(shù)去除羥基喜樹堿中的細菌內(nèi)毒素。

1.儀器與試藥

P230高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）； ABS220-4分析天平（德祥科技有限公司）；板框超濾膜（海寧市桃沅膜分離廠，截留分子量MWCO=10kDa）；QTR3120基本加熱型超聲波清洗器（天津市瑞普電子儀器公司）；BET-72細菌內(nèi)毒素測定儀（天大天發(fā)科技有限公司）；LPD2500多管漩渦混合儀（萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司）；XYG-H帕恩特痕量分析級超純水機（北京湘順源科技有限公司）；10L大型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京賽美思儀器設(shè)備有限公司）；KHW-D-1LC精密拉伸水浴鍋（上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司）；SHB-III 循環(huán)水真空泵（西安中諾儀器有限公司）；BT100-01蠕動泵（保定齊力恒流泵有限公司）；TGL20MW臺式大容量高速冷凍離心機（湖南赫西離心機儀器有限公司）；0.5平米板框式超濾器（吉林敖騰生物科技有限責(zé)任公司）；DGG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京鴻達天矩試驗設(shè)備有限公司）。動態(tài)濁度法鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司）；細菌內(nèi)毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（石家莊啟迪科技有限公司）；細菌內(nèi)毒素指示劑（北京欣惠澤奧科技有限公司）。

2.含量測定

2.1色譜條件

依據(jù)查閱文獻及考查的結(jié)果，確定色譜條件如下[10-12]。色譜柱為依利特hypersil BDSC18色譜柱（4.6*250*5u）；甲醇-水（85：15）為流動相；檢測波長為266nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：30℃。

2.2供試品溶液的制備

取羥基喜樹堿適量，精密稱取，置50mL量瓶中，加流動相適量，超聲提取20分鐘，放置至室溫，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3對照品溶液的制備

精密稱取羥基喜樹堿對照品約10mg，置100mL容量瓶中，用流動相超聲波振蕩溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.實驗方法

3.1供試樣品溶液的制備

稱取羥基喜樹堿1克，用100毫升注射用水溶解，加人細菌內(nèi)毒素適量，混勻，作為原液，標識備用。取上述配制好的藥液原液以10 kDa分子量超濾膜進行試驗。分別取藥液原液和超濾液檢測其中細菌內(nèi)毒素的含量。

3.2細菌內(nèi)毒素的檢測

3.2.1標準曲線的制作

分別配內(nèi)毒素濃度為2.0、0.5、0.125、0.03125EU/mL的標準溶液，各取0.1毫升分別加到預(yù)先加有0.1毫升鱟試劑溶液的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，進行檢測并同時作陰性對照2管。以反應(yīng)時間t的對數(shù)為縱坐標，細菌內(nèi)毒素濃度C為橫坐標，按最小二乘法進行統(tǒng)計分析，得標準曲線。

3.2.2干擾實驗及內(nèi)毒素定量測定

分別將各樣品藥液用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋，以此稀釋液作為供試液，同時分別將此倍數(shù)稀釋液配制成含內(nèi)毒素標準品0.5EU/mL的溶液，作為陽性對照。分別取上述溶液0.1毫升加到預(yù)先加有0.1毫升鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混勻，進行檢測。

4.結(jié)果與討論

細菌內(nèi)毒素，英文稱作Endotoxin，是G-菌細胞壁個層上的特有結(jié)構(gòu)，內(nèi)毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細胞等，使之釋放出一種內(nèi)源性熱原質(zhì)，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱。細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，當(dāng)細菌死亡或自溶后便會釋放出內(nèi)毒素。因此，細菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。內(nèi)毒素通過注射等方式進入血液時則會引起不同的疾病。內(nèi)毒素小量入血后被肝臟枯否細胞滅活，但大量內(nèi)毒素進入血液就會引起發(fā)熱反應(yīng)。因此，生物制品類、注射用藥劑、化學(xué)藥品類、疫苗類、透析液等制劑必須經(jīng)過細菌內(nèi)毒素檢測試驗合格后才能使用。細菌內(nèi)毒素具有耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性，不易被去除，目前注射劑生產(chǎn)常用活性炭吸附法去除熱原，但去除效率并不能保證。本實驗采用超濾技術(shù)去除羥基喜樹堿中的細菌內(nèi)毒素。超濾后有效成分的變化：原液（超濾前）高效液相測定含量為98.62EU/ml，總量為1克，有效成分量為98.61克，超濾后高效液相測定含量為99.09EU/ml，總量為0.98克，有效成分量為94.83克，透過率為96.2%。超濾后細菌內(nèi)毒素的去除效果：原液細菌內(nèi)毒素濃度為7.5216EU/ml，超濾后細菌內(nèi)毒素濃度為0.3003EU/ml，細菌內(nèi)毒素去除率為96.0%。超濾技術(shù)可以很好的去除羥基喜樹堿原料藥溶解液中細菌內(nèi)毒素，有效成分損失極其微少，可提高其用藥安全性。

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