毛烏素沙地典型湖濱濕地土壤石油降解菌分離與鑒定

申衛(wèi)博，張雪冰，王國(guó)棟

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100;2.中國(guó)科學(xué)院水利部水土保持研究所/黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西楊凌 712100)

石油是人類最主要的能源之一，被稱作工業(yè)的血液、黑色的金子。隨著石油需求量增加，大量的石油及其加工品進(jìn)入土壤，給人類和環(huán)境帶來(lái)巨大的危害。在石油開(kāi)采、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過(guò)程中都會(huì)造成土壤的污染，油田周圍大面積的土壤和水域一般都受到石油污染，造成河流濕地受到嚴(yán)重污染［1］。石油污染土壤不僅影響農(nóng)作物生長(zhǎng)，而且石油烴不易被土壤吸附的成分會(huì)滲透到地下水，影響飲用水的水質(zhì)［2］，進(jìn)而通過(guò)水和土壤轉(zhuǎn)移到生物體，對(duì)人類造成危害［3-4］。

對(duì)石油污染土壤進(jìn)行治理，使其在較短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)到可耕作的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有非常重要的意義，特別是微生物降解方法［5］進(jìn)行生物治理。微生物修復(fù)由于具有速度快、消耗少、不造成二次污染、費(fèi)用低、原位降解污染物等特點(diǎn)，是一種極有前途的技術(shù)。因此篩選高效降解石油的微生物菌種，對(duì)用于處理石油污染的土壤，將產(chǎn)生很大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益［6］。

微生物對(duì)石油污染的土壤的降解效果受土壤環(huán)境條件的影響［7］。因此要利用微生物修復(fù)石油污染的土壤，要先進(jìn)行油污土壤中石油降解菌的分離與鑒定。本實(shí)驗(yàn)選取毛烏素沙地典型湖濱濕地作為研究對(duì)象，研究了油污濕地的理化性質(zhì)，并對(duì)存在的石油降解菌進(jìn)行了分離鑒定，旨在為該地域的微生物修復(fù)油污濕地提供理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品的采集 2006—2013年，于毛烏素沙漠地區(qū)雨季開(kāi)始時(shí)期在巴嚇采當(dāng)?shù)哪习豆策x擇9個(gè)點(diǎn)采集土壤樣品。自湖邊向湖外圍進(jìn)行取樣，分別在距湖邊1 m，10 m和50 m處采樣。每個(gè)采樣點(diǎn)取3個(gè)重復(fù)，采集土樣厚度為0～30 cm，分為0～5 cm，5～10 cm 和10～20 cm 三層。將采集的土壤樣品封存于無(wú)菌塑料袋中，在4℃保存。土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行石油降解菌的分離培養(yǎng)。土壤理化性質(zhì)的測(cè)定采用風(fēng)干土壤樣品進(jìn)行。

表1 巴嚇采當(dāng)湖濱各采樣點(diǎn)的基本情況Tab.1 General situation of sample sites in Baxiacaidang Lake

1.1.2 石油降解菌分離培養(yǎng)基［6］A.石油降解富集培養(yǎng)基:MgS04`7H2O 0.4g，CaCl2·2H2O 0.02 g，K2HP04l g，KH2PO41g，NH4N03l g，酵母膏 l g，蒸餾水l L，微量元素液0.5%，F(xiàn)eCl30.05 g，pH值7.0～7.2，原油5%。

B.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏2.5 g，蛋白胨 5 g，NaCl 2.5 g，蒸餾水500 mL，pH 值7.2-7.4。

C.血平板:在121℃下將牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基滅菌15 min，冷卻至50℃后以1∶20加入脫纖維羊血(北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，搖勻后傾注培養(yǎng)基平板上。

D.油平板:將原油溶于25%石油醚中，將石油醚均勻涂布于無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板加1.0 mL原油溶液，待石油醚揮發(fā)石油凝固后即成油平板。

E.無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基:MgS04`7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.01 g，KH2PO40.5g，K2HP040.5g，NH4N030.5 g，酵母膏 0.5 g，蒸餾水 500mL，微量元素液0.5%，F(xiàn)eCl30.03 g，瓊脂9g，pH值7.0～7.2。

1.2 巴嚇采當(dāng)土壤理化性質(zhì)的測(cè)定［8］

土壤有機(jī)質(zhì)含量的測(cè)定采用重絡(luò)酸鉀外加熱容量法，全氮含量的測(cè)定采用半微量凱氏定氮法，速效氮含量的測(cè)定采用2mol·L-1KCl侵提——靛酚藍(lán)比色法測(cè)定，全磷含量采用HClO4-H2SO4法，速效磷含量的測(cè)定采用0.5 mol·L-1NaHCO3侵提——鉬銻抗比色法。土壤pH值采用pH計(jì)測(cè)定(m(土)∶V(水)=1.0∶2.5)。

1.3 石油降解菌的分離與鑒定

1.3.1 分離［6］9個(gè)采樣點(diǎn)各秤取5g土樣，利用石油降解菌富集培養(yǎng)基，富集培養(yǎng)7d。培養(yǎng)條件為30℃下180r/min。取富集液10mL接到富集培養(yǎng)基中再發(fā)酵7 d。如此循環(huán)培養(yǎng)4次后，將富集液稀釋為 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7和 10-8共 8 個(gè)稀釋度，取 10-6，10-7，10-83個(gè)稀釋度各0.1mL涂布于血平板上，放置在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h觀察。利用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)血平板上溶血圈較明顯的菌落2d，培養(yǎng)條件為30℃下180r/min。按上述方法進(jìn)行梯度稀釋，取10-6，10-7，10-83個(gè)稀釋度各0.1mL涂布于油平板，37℃恒溫培養(yǎng)2 d。利用牛肉膏蛋白胨平板分離油平板上噬油斑較明顯的菌株，分離成單菌落。

1.3.2 鑒定［9］菌體DNA的分離純化使用試劑盒，提取石油降解菌的基因組總DNA。

PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。16S rDNA由上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序完成。

序列同源性分析:序列信息輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTN比對(duì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件和SigmaPlot軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴嚇采當(dāng)湖濱土壤基本理化性質(zhì)分析

對(duì)巴嚇采當(dāng)9個(gè)采樣點(diǎn)土壤的基本理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，巴嚇采當(dāng)?shù)貐^(qū)土壤pH值大都在7.0以下，為偏酸性土壤。由表2可看出，蘆葦?shù)?、草木樨地和沙柳地的有機(jī)質(zhì)含量隨土壤深度增加呈降低趨勢(shì)，有機(jī)質(zhì)含量為3.47～72.36g/kg，西北地區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)含量一般在 6.0 ～10.0g/kg［10］，說(shuō)明巴嚇采當(dāng)?shù)貐^(qū)有機(jī)質(zhì)含量整體較高，這與濕地富營(yíng)養(yǎng)化及周圍農(nóng)田化肥污染相關(guān)。在0～5 cm層土壤有機(jī)質(zhì)含量為草木樨＞蘆葦＞沙柳，在5～10 cm層土壤有機(jī)質(zhì)含量為蘆葦＞草木樨＞沙柳，10～20 cm層土壤有機(jī)質(zhì)含量為草木樨＞蘆葦＞沙柳。蘆葦?shù)睾筒菽鹃赝寥烙袡C(jī)質(zhì)含量較高，可能是因含有大量腐殖質(zhì)。巴嚇采當(dāng)土壤硝態(tài)氮含量為2.57～14.19mg/kg，銨態(tài)氮含量為16.53～37.45mg/kg，土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量隨土壤深度增加呈先降低后升高的趨勢(shì)。全磷含量為0.28～1.04g/kg，土壤全磷含量與有機(jī)質(zhì)變化趨勢(shì)基本一致，利用SPSS做相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù) R=0.9750(p=0.01)，呈顯著正相關(guān)。速效磷含量為3.93～10.26mg/kg，比張姍姍［11］研究紅堿淖速效磷含量高，可能與巴嚇采當(dāng)周圍農(nóng)田使用磷肥有關(guān)。綜上分析可知，巴嚇采當(dāng)湖濱土壤為酸性土壤，土壤養(yǎng)分比紅堿淖湖濱土壤高。

2.2 巴嚇采當(dāng)湖濱土壤石油降解菌的篩選和鑒定

16S rDNA序列的測(cè)定結(jié)果用BLAST軟件與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，3-12與5-3都與炭疽桿菌(Bacillus anthraci)和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)親緣關(guān)系較近，同源性均達(dá)到99%。經(jīng)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析確定，可以將3-12鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)，5-3為蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)。3-12和5-3系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1。

表2 巴嚇采當(dāng)湖濱土壤的基本理化性質(zhì)Tab.2 Soil physic-chemical properties in Baxiacaidang Lakeside

圖1 石油降解菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 16S rDNA sequence homology analysis of oil degradation bacteria degradation strain

3 結(jié)論

1)巴嚇采當(dāng)?shù)貐^(qū)土壤為酸性土壤。土壤有機(jī)質(zhì)、全磷、速效磷等含量較高，這可能與水體富營(yíng)養(yǎng)化及周邊農(nóng)田化肥污染有關(guān)。

2)巴嚇采當(dāng)土壤與紅堿淖土壤相比，土壤酸堿性不同。巴嚇采當(dāng)為酸性土壤，紅堿淖為堿性或強(qiáng)堿性土壤。巴嚇采當(dāng)土壤的有機(jī)質(zhì)、全磷等含量高于紅堿淖。

3)巴嚇采當(dāng)土壤經(jīng)分離篩選后得出兩種石油降解菌，即蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽孢桿菌。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)毛烏素沙地典型湖濱濕地——巴嚇采當(dāng)土壤的理化性質(zhì)、石油降解菌資源做了初步調(diào)查，結(jié)果為該地區(qū)有機(jī)質(zhì)、全磷等含量比紅堿淖較高，為解決濕地石油污染，改良土壤奠定基礎(chǔ)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，筆者將采用室內(nèi)培養(yǎng)模擬實(shí)驗(yàn)的方法，針對(duì)土壤、環(huán)境等因子對(duì)石油降解菌降解石油效果的影響機(jī)理及適合沙地石油降解菌最優(yōu)配比做出進(jìn)一步研究。

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