空間生命科學(xué)共焦顯微圖像采集系統(tǒng)*

鞠洪偉，張 濤，鄭偉波，蔡 萍，劉方武

（1.中國(guó)科學(xué)院 上海技術(shù)物理研究所，上海 200083;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

0 引言

空間生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中在軌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、樣品的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與分析主要依靠生命科學(xué)儀器完成，而空間生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)用顯微鏡作為實(shí)驗(yàn)過(guò)程記錄和結(jié)果分析的可視化工具，是空間生命科學(xué)儀器的重要組成部分。目前，對(duì)生物樣品的顯微觀測(cè)手段主要包括普通光學(xué)顯微、熒光顯微以及共焦顯微等。共焦顯微技術(shù)作為現(xiàn)代生命科學(xué)研究重要的檢測(cè)手段，通過(guò)共焦光路和掃描技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)探測(cè)點(diǎn)的高分辨率掃描成像［1，2］，配合軸向步進(jìn)，可以完成樣品的光切，得到三維圖像。近年來(lái)，NASA成功研制共焦顯微模塊，并組合到光學(xué)顯微模塊（light microscopy module，LMM）中，用于在軌的微重力液體、物理和生物實(shí)驗(yàn)中的樣品顯微觀察。

隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)涉及的范圍越來(lái)越廣，而空間生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中需要顯微觀察的生物樣品可能具有活性和移動(dòng)性等特點(diǎn)，所以，空間生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中針對(duì)活體目標(biāo)進(jìn)行觀察的需求日益緊迫，而傳統(tǒng)的點(diǎn)式掃描共焦顯微鏡基于逐點(diǎn)掃描探測(cè)成像原理，往往在512×512圖像分辨率下，掃描成像時(shí)間在s級(jí)，很難在圖像幀頻上達(dá)到活體觀察要求。在逐點(diǎn)掃描方式中，每點(diǎn)的駐留時(shí)間很短，如要完成1 frame/s（512×512）的成像速度，激發(fā)光在每點(diǎn)的駐留時(shí)間只有4μs，要想在這么短的時(shí)間內(nèi)激發(fā)出探測(cè)器能夠探測(cè)到的熒光，就必須加大激發(fā)光的功率，這樣就會(huì)對(duì)樣品造成一定損傷。而應(yīng)用掃描盤進(jìn)行全視場(chǎng)同時(shí)掃描的共焦顯微系統(tǒng)同時(shí)激發(fā)約1000個(gè)針孔，掃描幀頻可以達(dá)到幾百赫茲，配合面陣弱光探測(cè)成像裝置，圖像幀頻可以達(dá)到活體觀察需求。由于掃描盤瞬間通過(guò)多個(gè)針孔激發(fā)樣品，所以，在每點(diǎn)的等效駐留時(shí)間要長(zhǎng)得多，這就可以降低激發(fā)光的功率，繼而降低系統(tǒng)的光毒性和光漂白效應(yīng)，所以，基于多針孔掃描盤的快速共焦顯微系統(tǒng)更適用于空間生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)時(shí)間的活體目標(biāo)觀察。目前各種熒光共焦顯微鏡中應(yīng)用較為成熟弱光探測(cè)器包括:光電倍增管（PMT）、雪崩二極管（APD）;多元面陣器件包括:高靈敏制冷CCD、微通道板或像增強(qiáng)CCD（ICCD）、電子倍增CCD（EMCCD）等。

1 共焦顯微原理與系統(tǒng)方案

基于針孔式掃描盤建立的快速共焦顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示，激發(fā)光源發(fā)出的光經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直、擴(kuò)束之后，透過(guò)分光鏡，依次經(jīng)過(guò)快速掃描盤和顯微物鏡。物鏡匯聚的激發(fā)光照射在樣品上，樣品受激發(fā)射的熒光按照原光路返回，當(dāng)發(fā)射熒光經(jīng)過(guò)快速掃描系統(tǒng)時(shí)，被濾去物方非焦面發(fā)射的雜散光。分光鏡反射的熒光經(jīng)過(guò)透鏡匯聚后被CCD接收，獲取樣品共焦顯微圖像。通過(guò)控制樣品在Z軸上步進(jìn)，進(jìn)而改變樣品的光切位置，可以獲得樣品不同切面的圖像，最終通過(guò)一定的圖像處理技術(shù)可以獲得樣品的三維圖像。

圖1 快速掃描共焦顯微系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of fast scanning confocal microscopy system

2 EMCCD相機(jī)結(jié)構(gòu)與組件內(nèi)容

圖1所建立的共焦顯微系統(tǒng)以針孔盤作為掃描部件，它以多點(diǎn)針孔同時(shí)對(duì)視場(chǎng)進(jìn)行掃描，因此，圖像采集器件宜采用面陣器件，綜合探測(cè)靈敏度、圖像輸出幀頻、空間應(yīng)用等角度考慮，系統(tǒng)采用EMCCD作為圖像采集器件。它與傳統(tǒng)CCD器件在感光、存儲(chǔ)等結(jié)構(gòu)上并無(wú)差異，之所以在探測(cè)靈敏度、信噪比上表現(xiàn)出色，是因?yàn)樵谄渥x出寄存器之后又多出了一串增益寄存器，增益寄存器的單個(gè)倍增單元如圖2所示。與普通的三相CCD轉(zhuǎn)移電極相比，EMCCD將Ф2分為Ф2和Фdc，一般Фdc接2 V左右的直流偏置，Ф2接高壓（40 V左右）轉(zhuǎn)移時(shí)鐘，由于Ф2與Фdc之間存在高壓差，當(dāng)信號(hào)電荷從Ф1向Ф2轉(zhuǎn)移時(shí)，強(qiáng)電場(chǎng)會(huì)使電荷加速并與其他電荷碰撞產(chǎn)生新的電子，電子被Ф2勢(shì)井收集實(shí)現(xiàn)1次信號(hào)倍增。單個(gè)倍增單元的倍增率是隨機(jī)的，一般在1% ～1.5%范圍內(nèi)，雖然單個(gè)倍增單元增益很低，但當(dāng)多個(gè)倍增單元級(jí)聯(lián)時(shí)，總增益由式（1）確定

其中，g為單個(gè)倍增單元的倍增率，n為倍增單元數(shù)，當(dāng)n取500時(shí)，總增益可能達(dá)2000倍以上。

圖2 單個(gè)倍增單元結(jié)構(gòu)Fig 2 Structure of single multiplier unit

系統(tǒng)采用英國(guó)E2V公司的CCD97器件作為成像探測(cè)器［3］，CCD97是減薄背照式幀轉(zhuǎn)移型 EMCCD，具有512×512有效像素，像素尺寸為16 μm×16 μm，它同時(shí)具有普通模式與倍增模式成像方式，相應(yīng)具有兩路讀出放大器。倍增模式下制冷到-40℃，可達(dá)30 photons/pixel/s（積分時(shí)間為0.1 s）的探測(cè)能力，滿足弱光探測(cè)需求，同時(shí)在11 MHz像素時(shí)鐘下，噪聲低于1電子/pixel，量子效率達(dá)90%以上，滿足高幀頻需求。

整套系統(tǒng)的電子學(xué)設(shè)計(jì)圍繞EMCCD的驅(qū)動(dòng)需求展開(kāi)，按功能主要?jiǎng)澐譃?個(gè)模塊:邏輯驅(qū)動(dòng)模塊、功率驅(qū)動(dòng)模塊和上位機(jī)圖像采集模塊，系統(tǒng)功能框圖如圖3所示。

圖3 EMCCD相機(jī)功能結(jié)構(gòu)Fig 3 Functional structure of EMCCD camera

2.1 邏輯驅(qū)動(dòng)模塊

邏輯驅(qū)動(dòng)模塊主要完成EMCCD幀轉(zhuǎn)移、行轉(zhuǎn)移、行輸出等邏輯信號(hào)輸出、AD時(shí)序控制輸出、SRAM時(shí)序控制輸出以及圖像數(shù)據(jù)串行輸出等功能，邏輯模塊核心器件采用ACTEL公司的APA300器件，它基于Flash技術(shù)，無(wú)需配置芯片，功耗低，對(duì)固件錯(cuò)誤有較好的免疫作用，可以抵御一些高能粒子的沖擊，最大優(yōu)勢(shì)在于在特殊環(huán)境下可以穩(wěn)定可靠地工作，適合航天領(lǐng)域的應(yīng)用。圖像信號(hào)采集部分用AD9824，它是ADI公司一種專用于CCD信號(hào)處理的AD器件，它包含14位精度最高采樣率為30MSPS的A/D轉(zhuǎn)換器，芯片內(nèi)部集成了相關(guān)雙采樣電路、像素增益放大器、可編程增益放大器。邏輯驅(qū)動(dòng)模塊的硬件程序各子模塊的調(diào)用關(guān)系如圖4所示。

圖4 硬件程序結(jié)構(gòu)Fig 4 Structure of hardware program

2.2 功率驅(qū)動(dòng)模塊

CCD97的驅(qū)動(dòng)除了對(duì)信號(hào)相位要求嚴(yán)格外，還要求信號(hào)電平和上升時(shí)間多樣化，針對(duì)不同信號(hào)的電平和上升時(shí)間需求，功率驅(qū)動(dòng)模塊采用4種電路方案，包括偏置電平電路、圖像轉(zhuǎn)移信號(hào)電路（ФIS，ФR）及高壓時(shí)鐘電路。

由于CCD97直流偏置所需電流不大，所以，偏置電平電路采用電阻分壓與運(yùn)放跟隨實(shí)現(xiàn)。圖像轉(zhuǎn)移信號(hào)上升時(shí)間較短，需要較大的驅(qū)動(dòng)電流，圖像幀轉(zhuǎn)移、行轉(zhuǎn)移、行輸出信號(hào)功率驅(qū)動(dòng)電路以EL7457作為核心器件。它是Elantec公司推出的四通道CMOS專用驅(qū)動(dòng)器，最高工作頻率可達(dá)40 MHz，最大驅(qū)動(dòng)電流2A，具有低輸出阻抗、外圍電路簡(jiǎn)單、方便電源管理等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于多電平復(fù)雜時(shí)序的CCD器件驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)。

圖像轉(zhuǎn)移信號(hào)功率驅(qū)動(dòng)電路如圖5所示［4］，由于ФI，Φs，ФR信號(hào)的上升時(shí)間要求不同，實(shí)際調(diào)試電路時(shí)選擇合適的電阻器（R1～R5）使得信號(hào)上升時(shí)間盡量滿足器件需求，保證輸出的圖像質(zhì)量較高。

圖5 圖像轉(zhuǎn)移信號(hào)驅(qū)動(dòng)電路Fig 5 Image transfer signal driving circuit

高壓時(shí)鐘是實(shí)現(xiàn)倍增模式成像的關(guān)鍵信號(hào)，它的電平?jīng)Q定了倍增增益，并最終影響器件在低照度下的成像效果。由于高壓時(shí)鐘的電平較高，一般在40 V左右，驅(qū)動(dòng)電流100 mA左右，使用集成元件很難實(shí)現(xiàn)，所以，高壓時(shí)鐘電路采用分立元件實(shí)現(xiàn)，電路如圖6所示［5］。

圖中電路的靜態(tài)偏置由二極管 D1，D2，D3，D4，D5，D6以及電阻器R1，R3，R4所組成的分壓網(wǎng)絡(luò)提供。Q1的柵源極靜態(tài)電壓約為-1 V，Q2的柵源極靜態(tài)電壓約為1 V。當(dāng)FPGA驅(qū)動(dòng)脈沖為低時(shí)，U1和U2的輸出為5V，Q1的柵源極電壓為-1 V，Q2的柵源極電壓為6 V，此時(shí)，Q1關(guān)斷，Q2導(dǎo)通，Φ2HV被拉低到0V;當(dāng)FPGA脈沖為高時(shí)，U1和U2的輸出為0V，Q1的Vgs為-6 V，Q2的Vgs為1 V，此時(shí)Q2關(guān)斷，Q1導(dǎo)通，Ф2HV被拉高到電源電壓Vhigh。Ф2HV的輸出相位與FPGA輸出邏輯信號(hào)相同，高低電平與高壓電源一致。

圖6 高壓時(shí)鐘驅(qū)動(dòng)電路Fig 6 High-voltage clock driving circuit

2.3 上位機(jī)軟件

上位機(jī)控制軟件主要負(fù)責(zé)指令編碼、指令下傳以及圖像數(shù)據(jù)接收、圖像數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、圖像顯示等工作。

上位機(jī)軟件開(kāi)發(fā)環(huán)境為VC++6.0，通過(guò)調(diào)用操作系統(tǒng)自帶的MScomm控件完成指令下傳與數(shù)據(jù)接收。通過(guò)點(diǎn)擊界面上的“打開(kāi)串口”按鈕建立相機(jī)與上位機(jī)間的通信，點(diǎn)擊“打開(kāi)相機(jī)”按鈕完成相機(jī)參數(shù)與開(kāi)機(jī)指令下傳，開(kāi)啟圖像數(shù)據(jù)接收線程，待正確接收數(shù)據(jù)包頭并完成一整幅圖像數(shù)據(jù)接收后，顯示接收?qǐng)D像并保存圖像數(shù)據(jù)。

3 圖像采集驗(yàn)證與分析

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)鏡頭采用MV2514機(jī)器視覺(jué)鏡頭，該鏡頭放大倍率為0.23倍，焦距為25 mm，F(xiàn)數(shù)可小至1.4，可見(jiàn)光波段內(nèi)透過(guò)率約90%，機(jī)械接口為標(biāo)準(zhǔn)C接口，可兼容2/3 in CCD，最小工作距130mm。實(shí)驗(yàn)中采用6mm特寫環(huán)在0.01 lx微光、100 ms積分時(shí)間、2 dB增益條件下使用普通模式與倍增模式分別對(duì)同一目標(biāo)成像，圖像如圖7所示。

圖7 普通模式與倍增模式圖片F(xiàn)ig 7 Normal and multiplication mode image

從獲得的暗背景條件下的圖像數(shù)據(jù)可計(jì)算出噪聲平均灰度值與方差，分別選擇普通模式下與倍增模式下目標(biāo)圖像的最亮點(diǎn)作為信號(hào)，取多幅圖像數(shù)據(jù)的亮點(diǎn)信號(hào)并計(jì)算平均值，可以獲得普通模式下與倍增模式下的信噪比，列于表1。

表1 實(shí)驗(yàn)對(duì)比數(shù)據(jù)Tab 1 Contrast data of experiment

從表中可以得出:相比普通模式，在44 V倍增時(shí)鐘電壓驅(qū)動(dòng)下，倍增模式輸出圖像的信號(hào)有7倍提升，信噪比也有8倍提升，證明CCD97在微弱光條件下，使用倍增模式可以獲得較高質(zhì)量的目標(biāo)圖像。

根據(jù)圖1搭建共焦顯微系統(tǒng)，使用40倍物鏡對(duì)擬南芥進(jìn)行熒光顯微成像。普通顯微模式與共焦顯微模式分別對(duì)樣品所成圖像如圖8所示。

EMCCD相機(jī)倍增模式與普通模式使用相同AD增益，積分時(shí)間分別取100，50 ms。從圖8可以看出:EMCCD在倍增模式下可以獲得比較清晰的擬南芥葉肉共焦顯微熒光圖像。相比普通顯微模式，由于對(duì)樣品進(jìn)行光切的原因，使得系統(tǒng)在共焦顯微模式下可以清晰的分辨出擬南芥葉肉葉綠體。

圖8 擬南芥葉綠素?zé)晒鈭D像Fig 8 Fluorescence image of chlorophyll

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)空間生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中共焦顯微的原理分析，提出一套適用于活體目標(biāo)觀察、對(duì)樣品低損傷的共焦顯微方案。根據(jù)目標(biāo)的掃描方案和獲取目標(biāo)發(fā)射光的能量大小提出基于CCD97的弱光圖像采集系統(tǒng)，將系統(tǒng)分成3個(gè)功能模塊分別實(shí)現(xiàn)并最終完成原理樣機(jī)研制。在普通模式與倍增模式下分別獲取目標(biāo)圖像，從圖像效果可以看出:該成像系統(tǒng)性能較高，對(duì)弱光目標(biāo)有很好的成像效果，且該系統(tǒng)具有體積小、可靠性高、適合空間應(yīng)用等特性。

［1］Gu Min.共焦顯微術(shù)的三維成像原理［M］.王桂英，陳 偵，楊莉松，譯.北京:新時(shí)代出版社，2000:14-51.

［2］Colin J R Sheppard.Aberrations in high aperture conventional and confocal imaging systems［J］.Applied Optics，1988，27（22）:4782-4786.

［3］E2V Technologies inc.CCD97—00 back illuminated 2-phase IMO series electron multiplying CCD sensor［EB/OL］.［2004—05—11］.http://www.e2vtechnologies.com.

［4］孫 靜，張保平，曹睿學(xué).基于EMCCD的驅(qū)動(dòng)電路設(shè)計(jì)［J］.現(xiàn)代電子技術(shù)，2011，34（4）:150-154.

［5］Texas Instruments.TC285SPD—B0 1004 ×1002 pixel impactron CCD image sensor［EB/OL］.［2004—05—31］.http://www.ti.com.