高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)蛋白飲料中安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的前處理方法研究

【摘要】建立了二極管陣列─反相高效液相色譜同時(shí)快速測(cè)定蛋白飲料中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸五種食品添加劑的檢測(cè)技術(shù)。本文改進(jìn)的前處理方法操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)精確度和準(zhǔn)確度良好，非常適合應(yīng)用在大量蛋白飲料樣品的快速檢測(cè)工作中。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜；蛋白飲料；安賽蜜；苯甲酸；山梨酸；糖精鈉；脫氫乙酸

在檢測(cè)安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸等指標(biāo)的前處理過(guò)程中，需要對(duì)提取液進(jìn)行過(guò)濾，而蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量較高，影響過(guò)濾效率，是影響上述添加劑快速檢測(cè)的主要環(huán)節(jié)。在水中，苯甲酸和山梨酸溶解度較低，按照GB/T23495采用亞鐵氰化鉀和醋酸鋅進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀[1]后，苯甲酸和山梨酸與雜質(zhì)一起沉淀，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性[2，3]。而按照GB/T21703調(diào)節(jié)pH值后，用亞鐵氰化鉀和醋酸鋅沉淀蛋白質(zhì)，再用甲醇定容[4]，則液相色譜圖中組分峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，影響組分峰定量的準(zhǔn)確性。因此有必要針對(duì)蛋白飲料的前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，論證檢驗(yàn)方法的實(shí)用性，使得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，操作更為簡(jiǎn)單，便于在基層常規(guī)檢測(cè)工作中推廣。

1、材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器 Waters e2695分離模塊，Waters 2998 PDA檢測(cè)器，超聲清洗器。

1.1.2試劑 色譜純甲醇，超純水，0.5mol/L氫氧化鈉，0.42mol/L 硫酸鋅，0.02mol/L乙酸銨，1.00mg/mL苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），配制250mg/L的安賽蜜儲(chǔ)備液和110mg/L的脫氫乙酸儲(chǔ)備液（北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院）。

1.1.3色譜條件 色譜柱：TopsilTMC18（250mm×4.6mm×5μm）色譜柱，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm，流動(dòng)相：甲醇：0.02mol/L的乙酸銨（8：92），流速：1.0mL/min，進(jìn)樣體積：20μL。

1.2前處理方法

稱(chēng)取1g蛋白飲料（精確至0.001g）于50mL比色管中，加入1mL NaOH溶液，搖勻，加入2mL有機(jī)沉淀劑，再分別加入1.5mL ZnSO4溶液、1.5mLNaOH溶液和5mL超純水，超聲處理后用超純水定容至刻度，混勻，靜置5min。上清液過(guò)濾（雙層濾紙），濾液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)。

2、結(jié)果與分析

2.1樣品前處理

蛋白飲料中蛋白質(zhì)含量較高，在前處理過(guò)程中樣品極難通過(guò)濾紙和濾膜，很大程度上影響了檢測(cè)效率，因此需要采取有力措施除去蛋白質(zhì)。因苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸在水中的溶解度較低，加入蛋白質(zhì)沉淀劑后與雜質(zhì)一起被沉淀，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性[2]，因此需要先將苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸轉(zhuǎn)化為易溶于水的鹽。另外，氫氧化鈉有沉淀蛋白質(zhì)的作用[5]，因此本文選擇先用氫氧化鈉促進(jìn)苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸在水中的溶解。

由于硫酸鋅和氫氧化鈉對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀能力有限，考慮在不稀釋樣品的前提下，先加入硫酸鋅和氫氧化鈉并添加少量有機(jī)試劑使樣液先進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，再進(jìn)行稀釋和超聲處理。我們選用常用的有機(jī)試劑甲醇、乙腈、丙酮、正己烷進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀試驗(yàn)，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)改進(jìn)的沉淀劑添加方法，能明顯加強(qiáng)蛋白飲料中蛋白質(zhì)的沉淀，當(dāng)添加2mL甲醇、乙腈或丙酮時(shí)，與不加有機(jī)試劑相比，樣液分層效果更佳。幾種有機(jī)試劑相比，正己烷的分層效果最差。

從色譜圖來(lái)看，加甲醇沉淀蛋白質(zhì)，苯甲酸的峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，如圖1所示。因?yàn)榧状紭O性相對(duì)較大，使得檢測(cè)樣液極性與流動(dòng)相極性差別加大，影響目標(biāo)化合物在色譜柱中的分離，表現(xiàn)為峰拖尾現(xiàn)象。

圖1 添加甲醇的樣液中的混標(biāo)色譜圖

在同一蛋白飲料中，添加安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的混合標(biāo)樣，樣品定容后，這五種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度分別為：安賽蜜0.354mg/L、苯甲酸和糖精鈉各0.200mg/L、山梨酸0.242mg/L、脫氫乙酸0.210mg/L。選取沉淀效果最好的丙酮和乙腈作為有機(jī)沉淀劑對(duì)樣品前處理后，分別超聲處理15min和30min，再進(jìn)行上機(jī)測(cè)試，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。由表1，可知經(jīng)丙酮和乙腈沉淀的樣品，超聲處理15min后，糖精鈉和脫氫乙酸的回收率較低。考慮到前處理過(guò)程中添加劑分散不夠均勻的可能，延長(zhǎng)超聲時(shí)間至30min，由測(cè)試結(jié)果可知，添加丙酮的樣品中糖精鈉和脫氫乙酸的回收率均有較大提升，而添加乙腈的樣品中糖精鈉和脫氫乙酸的回收率變化較小。因此，確定前處理過(guò)程中，以丙酮作為有機(jī)沉淀劑，超聲處理時(shí)間為30min。

表1 不同前處理方法的各組分回收率

檢測(cè)項(xiàng)目回收率（%）

丙酮沉淀，超聲15min丙酮沉淀，超聲30min乙腈沉淀，超聲15min乙腈沉淀，超聲30min

安賽蜜92.5694.5192.8393.56

苯甲酸109.75107.26107.6799.75

山梨酸90.6192.3091.2292.82

糖精鈉81.9198.5384.1084.13

脫氫乙酸78.1592.0174.1573.04

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e進(jìn)樣20μL，五種食品添加劑組分均呈良好線性關(guān)系，見(jiàn)表1。

表2 相關(guān)性分析

檢測(cè)項(xiàng)目范圍（mg/L）回歸方程相關(guān)系數(shù)方法檢出限（mg/L）

安賽蜜0.0-2.0y=58320x-1020.70.99990.0175

苯甲酸0.0-2.0y=77893x-1367.91.00000.0176

山梨酸0.0-2.0y=110188x-1896.10.99990.0172

糖精鈉0.0-2.0y=46719x-2310.70.99970.0495

脫氫乙酸0.0-2.2y=117808x-306310.99310.2600

2.3精確度試驗(yàn)

對(duì)同一蛋白飲料進(jìn)行六次平行試驗(yàn)，其結(jié)果如表2所示。

表3 精確度試驗(yàn)

檢測(cè)項(xiàng)目樣品測(cè)定值平均值RSD

%

123456

安賽蜜0.46620.46620.46990.47030.47050.46720.46840.44

苯甲酸0.42750.41060.44640.41840.44060.44250.43103.36

山梨酸0.41410.40270.40560.40770.40520.40640.40700.95

糖精鈉0.39260.37220.38300.37410.38050.39740.38332.61

脫氫乙酸0.37880.38560.38580.39700.39350.41040.39192.84

2.4準(zhǔn)確度試驗(yàn)

在同一不含五種食品添加劑的蛋白飲料中，加入這五種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加入后的濃度分別為：安賽蜜0.50mg/L、苯甲酸0.40mg/L、山梨酸0.40mg/L、糖精鈉0.40mg/L、脫氫乙酸0.44mg/L，采取五平行試驗(yàn)。平均回收率分別為安賽蜜93.68%、苯甲酸107.33%、山梨酸101.74%、糖精鈉95.59%、脫氫乙酸88.05%，其結(jié)果處于85到110之間，結(jié)果可信。

3、結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)蛋白飲料前處理方法的改進(jìn)，建立了可靠性高、操作簡(jiǎn)單、可準(zhǔn)確同時(shí)測(cè)定常見(jiàn)五種添加劑的HPLC檢測(cè)方法。此方法能夠滿(mǎn)足實(shí)際工作需要，為基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和企業(yè)提供了一種新的檢驗(yàn)方法。

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