冠心寧片改善氣滯血瘀大鼠微循環(huán)機(jī)制探究

施佳君 陳 宇 楊欽欽 馬全鑫 富丹婷 陳姣姣 李園園 陳民利#

1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江杭州 310007

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江杭州 310053

冠心寧片由丹參和川芎組成的復(fù)方制劑，具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心之功效，現(xiàn)已是臨床上治療穩(wěn)定性冠心病心絞痛（心血瘀阻證）的常用藥物。研究顯示，冠心寧片可有效增加麻醉犬冠脈流量，改善心臟的血流動(dòng)力學(xué)[1]，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冠心寧片有降血壓作用，離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冠心寧片有擴(kuò)血管作用，且其擴(kuò)血管作用與血管環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞中的鈣離子通道及鈣調(diào)蛋白有很大的關(guān)系[2]。本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究冠心寧片對(duì)氣滯血瘀大鼠血液流變和表皮血流灌注的改善作用，并通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)探究微循環(huán)的改善與血管平滑肌細(xì)胞中的鈣離子之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)雄性SD 大鼠36 只，體質(zhì)量為200±10g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2017-0005］；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室［SYXK（浙）2013-0184］；環(huán)境溫度：22±1℃；相對(duì)濕度50%～65%；光照12小時(shí)明暗交替（早7∶30～晚19∶30）；噪音：＜50dB。大鼠飼養(yǎng)于IVC 中，每籠3 只飼養(yǎng)，自由飲食；試驗(yàn)期間，遵循3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器：分述如下。

1.2.1 主要試劑：去氧腎上腺素（7161001）購(gòu)于上海禾豐制藥有限公司，肝素（141209）購(gòu)于常州千紅生化制藥股份有限公司。無(wú)鈣Krebs 液成分（mmol/L）：NaCl 120.8，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO4.7H2O 1.2，NaHCO325，葡萄糖11.0，EGTA 0.1，pH 調(diào)整到7.4。無(wú)鈣高鉀（40mmol/L）Krebs 液的成分（mmol/L）：NaCl 85.5，KCl 40，KH2PO41.2，MgSO4.7H2O 1.2，NaHCO325，葡萄糖11.0，PH調(diào)整到7.4。

1.2.2 主要儀器：BY-N6B 型全自動(dòng)模塊血液流變儀（北京普力生精密儀器研究中心），PeriSean PIMⅡ型激光多普勒血流灌注成像儀(瑞典PERIMED 公司)，HSS-1B型恒溫浴槽、SQG-4 型四腔器官浴槽系統(tǒng)（成都儀器廠），MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（南京美易公司）。1.3 動(dòng)物分組與造模：將36只SD大鼠按體重隨機(jī)分成6 組，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、冠心寧片低、中、高劑量組和冠心寧注射液組?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組每日灌胃生理鹽水（NS）10ml/kg，冠心寧低、中、高劑量組每日分別灌胃相應(yīng)低（15mg/ml）、中（30mg/ml）、高濃度（60mg/ml）的冠心寧片溶液10ml/kg，冠心寧注射液組給予原液1ml/kg，連續(xù)14 天。于第14 天給藥1 小時(shí)后，除空白組大鼠外，其他各組大鼠皮下注射0.1%腎上腺素0.8ml/kg，2小時(shí)后將大鼠浸入冰水中5分鐘，隔2小時(shí)再皮下注射0.1%腎上腺素0.6ml/kg[3]。

1.4 指標(biāo)觀察與測(cè)定：分述如下。

1.4.1 一般情況觀察：觀察各組大鼠的癥狀改變、行為活動(dòng)活躍程度及精神狀態(tài)。

1.4.2 微循環(huán)檢測(cè)：次日給藥1小時(shí)后，經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉（0.15ml/kg），用激光多普勒成像儀檢測(cè)大鼠耳朵（整個(gè)耳廓區(qū)域）、腹部（腹中左側(cè)定點(diǎn)區(qū)域）、腳踝（關(guān)節(jié)位置）的血流情況。本研究使用掃描模式（NR），掃描面積(Width2.8cm，Height2.1cm)，掃描精度（Middle），采樣頻率（8 圖像/s），距離（9.9cm），分辨率（0.06mm），激光波長(zhǎng)為670 nm 進(jìn)行掃描并對(duì)血流圖片進(jìn)行記錄、分析、處理及儲(chǔ)存。

1.4.3 血黏度檢測(cè)：激光多普勒檢測(cè)完，快速心臟取血，取2ml 放入含20μl 肝素鈉的塑料管，即刻顛倒混勻，用于血黏度的測(cè)定。

1.5 離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)測(cè)定冠心寧片對(duì)平滑肌細(xì)胞中鈣離子（Ca2+）的影響：分述如下。

1.5.1 Ca2+對(duì)冠心寧片舒張血管的作用：先將血管環(huán)于無(wú)鈣Krebs液中以2g最適靜息張力平衡2h后，換無(wú)Ca2+高K+Krebs 液平衡20min，再向浴槽內(nèi)加入2.5mmol/L的CaCl2收縮血管直至穩(wěn)定，然后每隔10min 向浴槽內(nèi)依次加入終濃度分別為0.5、1、2、4、8mg/ml的冠心寧片溶液，對(duì)照組以生理鹽水代替藥物等容加入，以2.5 mmol/L CaCl2誘發(fā)最大收縮幅度為100%，以加入不同濃度的冠心寧片溶液后的血管張力幅度與CaCl2誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化，并作量-效曲線。另外前期去極化操作一致，使用4mg/ml的冠心寧溶液孵育去內(nèi)皮血管環(huán)10min，記錄此時(shí)的收縮幅度為100%，以加入不同濃度的CaCl2后的血管張力幅度與未加CaCl2時(shí)的收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化，并作量-效曲線。

1.5.2 冠心寧片對(duì)肝素預(yù)處理的血管環(huán)的作用：以無(wú)鈣Krebs液預(yù)處理去內(nèi)皮的血管環(huán)，觀察8mg/ml的冠心寧片對(duì)10-6mol/L PE 預(yù)收縮血管環(huán)的作用，然后用無(wú)鈣Krebs 液洗脫恢復(fù)至基線，并平衡20min 后，以50mg/L 肝素預(yù)處理去內(nèi)皮血管環(huán)15min，再觀察8mg/ml 的冠心寧片對(duì)10-6mol/L PE 預(yù)收縮血管環(huán)的作用。比較前后兩次血管環(huán)收縮的程度，對(duì)照組以生理鹽水代替藥物等容加入。

1.5.3 冠心寧片對(duì)咖啡因誘導(dǎo)的血管環(huán)的作用：以無(wú)鈣Krebs液預(yù)處理去內(nèi)皮的血管環(huán)，加入50mM的咖啡因預(yù)收縮血管環(huán)，觀察8mg/ml 的冠心寧片對(duì)血管環(huán)的作用，對(duì)照組以生理鹽水代替藥物等容加入。以50mmol 的咖啡因誘發(fā)最大收縮幅度為100%，以加入8mg/ml 的冠心寧片后的血管張力幅度與咖啡因誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示，計(jì)量資料應(yīng)用ANOVA 方差分析評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察情況：與空白對(duì)照組比較，各組冰水浴之后均出現(xiàn)打寒顫，噴嚏，流涕，背弓毛松，唇口鼻耳四肢色紫等癥狀。造模后各組出現(xiàn)耳廓欠潤(rùn)澤，微血管呈暗紅色，大便稀等情況，行為活躍程度均降低，其中模型組更為嚴(yán)重，冠心寧片給藥組較模型組癥狀均有不同程度的緩解，冠心寧片中高劑量組效果更為明顯，冠心寧注射液組與冠心寧片中高劑量組效果相似。

2.2 微循環(huán)檢測(cè)結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的耳朵區(qū)域、腹部和腳踝區(qū)域的表皮血流灌注明顯降低，冠心寧中、高劑量組能增加耳朵區(qū)域的表皮血流灌注（P＜0.05），冠心寧高劑量組能顯著增加腹部（P＜0.01）和腳踝區(qū)域的表皮的血流灌注（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、圖2。

2.3 大鼠血液流變學(xué)情況：如表1所示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠在低切、中切、高切三種狀態(tài)下的全血黏度、紅細(xì)胞電泳時(shí)間及卡松黏度等指標(biāo)均顯著升高（P＜0.01），給予中、高劑量的冠心寧片后均可顯著降低低切、中切、高切三種狀態(tài)下的全血黏度（P＜0.05），給予低、中高劑量的冠心寧片降低紅細(xì)胞電泳時(shí)間和卡松黏度的趨勢(shì)，但效果均低于陽(yáng)性藥組，均與空白對(duì)照組有差距。

表1 冠心寧片對(duì)血瘀證大鼠血液流變學(xué)的影響（±s）

表1 冠心寧片對(duì)血瘀證大鼠血液流變學(xué)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組冠心寧片低劑量組冠心寧片中劑量組冠心寧片高劑量組冠心寧注射液組卡松黏度1.05±0.02 1.67±0.10##1.55±0.08##1.54±0.08##1.53±0.04##*1.32±0.09#*劑量10ml/kg NS 10ml/kg NS 150mg/kg 300mg/kg 600mg/kg 1ml/kg全血高切（200/s）3.74±0.07 4.68±0.10##4.36±0.12##4.32±0.06##*4.27±0.07##*4.05±0.17*全血中切（30/s）4.24±0.08 5.36±0.12##5.01±0.14##4.94±0.08##*4.94±0.08##*4.62±0.21*全血低切（3/s）7.45±0.14 10.72±0.21##9.70±0.21##*9.44±0.26##*9.38±0.16##**8.64±0.44**紅細(xì)胞電泳時(shí)間（s）14.04±0.25 16.56±0.49##16.35±0.45##16.55±0.37##16.38±0.30##15.52±0.65

2.4 Ca2+參與冠心寧片對(duì)血管環(huán)的作用：由圖3 可知，給予終濃度為2～8mg/ml 的冠心寧片溶液可使2.5mmol/L CaCl2預(yù)收縮的血管環(huán)顯著舒張（P＜0.01，P＜0.05），4mg/ml 的冠心寧片溶液孵育后，給予0.3～10mmol/L 的CaCl2溶液，血管環(huán)收縮被顯著抑制（P＜0.01），且呈一定的劑量依賴性。

2.5 冠心寧片對(duì)肝素預(yù)處理的血管環(huán)的作用：由圖4可知，用無(wú)鈣K-H 液加50mg/L 肝素預(yù)處理去內(nèi)皮血管環(huán)，給予8mg/ml 的冠心寧片溶液對(duì)PE 收縮血管環(huán)的舒張作用被顯著抑制（P＜0.01）。

2.6 冠心寧片對(duì)咖啡因誘導(dǎo)的血管環(huán)的作用：由圖5可知，用無(wú)鈣K-H 液預(yù)處理去內(nèi)皮血管環(huán)，給予8mg/ml的冠心寧片溶液并不能顯著抑制50mmol 的咖啡因誘導(dǎo)的收縮作用（P＞0.05）。

3 討論

氣滯血瘀是冠心病心絞痛的主要病機(jī)，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)暴怒、寒邪的病因，采用皮下注射腎上腺素和冰水浴模擬人暴怒時(shí)的機(jī)體狀態(tài)和寒邪入侵機(jī)體，制備大鼠氣滯血瘀模型[3]。中醫(yī)血瘀的特征為“血液該動(dòng)而止，瘀血該動(dòng)而留，脈道該通而塞”[4]。如何活血去瘀？《素問(wèn)·至真要大論》：“必先五勝，疏其血?dú)?，令其調(diào)達(dá)，而至和平。”[5]冠心寧片由丹參和川芎等組成，具有活血化瘀的功效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，冠心寧片能增加氣滯血瘀大鼠的血液流變學(xué)，從而改善微循環(huán)。

舒張血管是改善微循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，而血管平滑肌在血管舒縮中又起到了重要作用。血管平滑肌的收縮最主要受到Ca2+的調(diào)控，胞內(nèi)Ca2+濃度升高是誘導(dǎo)血管收縮的離子基礎(chǔ)[6]。在無(wú)Ca2+K-H 液中，給予終濃度為2～8mg/ml的冠心寧片溶液可使2.5mmol/L CaCl2預(yù)收縮的血管環(huán)顯著舒張,且呈一定的濃度依賴性，說(shuō)明冠心寧片能抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流，且隨著濃度的增加這種作用更加顯著。

胞內(nèi)Ca2+濃度升高主要通過(guò)外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放實(shí)現(xiàn)。鈣內(nèi)流的途徑主要有電壓依賴性鈣通道（VDC）和受體激活性鈣通道（ROC）。KCl 引起血管平滑肌細(xì)胞去極化，激活電壓依賴性的鈣通道VDC，使流入胞內(nèi)的Ca2+與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的ryanodine 受體結(jié)合，促使內(nèi)鈣釋放，引起血管收縮[7]。本研究將血管環(huán)用無(wú)鈣高鉀的營(yíng)養(yǎng)液處理，使血管平滑肌細(xì)胞外的K+濃度遠(yuǎn)大于細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)K+內(nèi)流及平滑肌去極化，導(dǎo)致VDC 開(kāi)放。結(jié)果顯示，預(yù)先孵育冠心寧片溶液后再加入梯度濃度的CaCl2，則血管環(huán)的收縮程度明顯減弱，說(shuō)明冠心寧片可以抑制VDC介導(dǎo)的細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞收縮，發(fā)揮血管舒張的作用。另外，在血管平滑肌細(xì)胞膜上磷脂酶C（PLC）能將肌醇磷脂分解成二磷酸磷脂酰肌醇產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇（IP3），IP3與特異性受體結(jié)合后可引起胞內(nèi)Ca2+池釋放Ca2+，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，進(jìn)而對(duì)血管產(chǎn)生較強(qiáng)的收縮作用[8]。

本研究用IP3受體拮抗劑肝素預(yù)處理去內(nèi)皮血管環(huán)，阻斷IP3誘導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放[9]，結(jié)果顯示冠心寧片對(duì)PE收縮的血管環(huán)舒張作用被顯著抑制，故推測(cè)冠心寧片可阻斷ROC。咖啡因誘導(dǎo)的收縮是由咖啡因敏感鈣池的Ca2+釋放導(dǎo)致的，冠心寧片并不能顯著抑制咖啡因的收縮作用，故推測(cè)冠心寧片并不是通過(guò)抑制咖啡因敏感鈣池的Ca2+釋放而起到舒張血管的作用。本課題組前期的研究表明冠心寧片能抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，該結(jié)果進(jìn)一步印證了前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

因此，筆者認(rèn)為冠心寧片通過(guò)降低肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度改善微循環(huán)，降低胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，VDC 和ROC 可能是其外Ca2+內(nèi)流的靶點(diǎn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上IP3可能是其細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的靶點(diǎn)。