黑毛茶中產(chǎn)單寧酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究

鄭重誼，王嬌嬌，資 云，張冬雪，周 輝

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

湖南黑茶是以湖南黑毛茶（老青茶）為原料蒸壓成形的緊壓茶的總稱，它的加工包括殺青、揉捻、渥堆、干燥等多道工序，其中渥堆是關(guān)鍵工序［1］，通過霉菌、酵母、細(xì)菌等微生物的發(fā)酵［2］，形成黑毛茶的獨(dú)特風(fēng)味［3］。溫瓊英等［4］研究發(fā)現(xiàn)，真菌數(shù)量隨渥堆時(shí)間的延長(zhǎng)遞增。董坤等［5］研究發(fā)現(xiàn)，以曲霉為主的霉菌和以產(chǎn)酒精和酯等生香酵母為主的酵母菌是普洱茶渥堆過程中的優(yōu)勢(shì)菌種。黑曲霉能降解單寧，產(chǎn)生沒食子酸［6－7］，使普洱茶形成深紅色的湯色［8］。黑茶中的另一種真菌冠突散囊菌能產(chǎn)生各種胞外酶，促進(jìn)催化氧化、聚合、降解、轉(zhuǎn)化等反應(yīng)，改善茶的品質(zhì)［9］，并且該真菌能在單寧為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，具有降解單寧的能力，能降低茶葉苦澀味，使茶葉滋味醇和［10］。

單寧酶，又叫單寧酯酰水解酶，可以水解沒食子酸丙酯而生成沒食子酸，是目前唯一能將茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯轉(zhuǎn)化為表沒食子兒茶素的酶［11－12］，在茶多酚單體的制備上具有重要作用。雖然單寧酶在食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)都有著廣泛的應(yīng)用，但生產(chǎn)成本較高，極大地限制了單寧酶的應(yīng)用。微生物源單寧酶屬于誘導(dǎo)酶，在制備過程中往往需要加入單寧酸或富含單寧酸的物質(zhì)（如五倍子渣）。若利用五倍子渣作為基質(zhì)直接進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，不僅可以提高五倍子中單寧酸的提取效率，還可以拓寬單寧酶的來源渠道。

作者在此對(duì)湖南益陽(yáng)安化黑茶產(chǎn)區(qū)黑毛茶渥堆過程中產(chǎn)單寧酶真菌進(jìn)行篩選和初步鑒定，并對(duì)其產(chǎn)單寧酶條件進(jìn)行優(yōu)化。擬為開發(fā)利用黑毛茶渥堆過程中的微生物資源、深入了解渥堆過程中微生物的作用機(jī)制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與培養(yǎng)基

黑毛茶樣品，取自湖南益陽(yáng)安化縣某黑茶廠渥堆階段，裝入采集袋中，4 ℃保存，備用。

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：將馬鈴薯去皮切塊，稱取300g，加水1 000mL，煮沸10～20 min，雙層紗布過濾，取濾液，用水補(bǔ)足至1 000mL，加葡萄糖20g、瓊脂20g，自然pH 值，于121 ℃下高壓滅菌20min。

篩選培養(yǎng)基：蔗糖1.0%，NaNO30.3%，K2HPO40.1%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO40.001%，單寧酸2%，自然pH 值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取提取單寧酸后的五倍子渣及麩皮的混合物共5g，裝入250 mL 三角瓶中，加無(wú)機(jī)鹽溶液5 mL。無(wú)機(jī)鹽溶液組分為：NH4NO30.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、NaCl 0.1%。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)單寧酶真菌的篩選

稱取25g黑毛茶樣品，置于225mL 無(wú)菌生理鹽水中，10倍梯度稀釋后，吸取100μL 稀釋液，涂布在添加了單寧酸及指示劑溴酚蘭（0.004%）的篩選培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)5d（產(chǎn)單寧酶真菌的生長(zhǎng)會(huì)使培養(yǎng)基由藍(lán)色變?yōu)辄S色，從而形成變色圈），挑取菌落較大且變色圈直徑較大的菌落至無(wú)菌的PDA 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間，取孢子進(jìn)行梯度稀釋，從平板上挑取單菌落進(jìn)行純化，保存。對(duì)變色圈較大的真菌進(jìn)行鏡檢，初步鑒定其歸屬。將產(chǎn)酶活性最高的菌株編號(hào)為WC－2。

1.2.2 孢子懸浮液的制備

首先將菌株WC－2在PDA 斜面上進(jìn)行活化培養(yǎng)，接著取28 ℃培養(yǎng)5d的新鮮斜面若干支，每支加入5 mL無(wú)菌生理鹽水，用無(wú)菌接種環(huán)將斜面上的孢子刮下來，將孢子懸浮液移入滅菌的空三角瓶中，振蕩搖勻。以上操作均在無(wú)菌臺(tái)中進(jìn)行，孢子懸浮液中的孢子數(shù)量可利用PDA 平板計(jì)數(shù)。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵制備單寧酶

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1 mL 孢子懸浮液，充分振蕩使孢子與培養(yǎng)基混合均勻后，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。

1.2.4 粗酶液的提取

從培養(yǎng)箱中取出發(fā)酵后的固態(tài)基質(zhì)，加入50mL pH 值為5.0的檸檬酸緩沖溶液，于160r·min－1搖床振蕩30min，過濾，即得粗酶液。

1.2.5 單寧酶活力的測(cè)定

根據(jù)單寧酶水解沒食子酸丙酯可產(chǎn)生沒食子酸，沒食子酸與甲醇繞單寧溶液在堿性條件下形成的色團(tuán)物質(zhì)在520nm 處具有最大吸收的原理進(jìn)行測(cè)定［13］。

酶活力單位定義為：在30 ℃下，每分鐘分解產(chǎn)生1μmol沒食子酸所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.2.6 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種WC－2孢子懸浮液后，放入溫度分別為25 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后提取單寧酶并測(cè)定酶活力，考察發(fā)酵溫度對(duì)菌株WC－2產(chǎn)單寧酶的影響。

1.2.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種WC－2 孢子懸浮液后，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h 測(cè)定單寧酶活力。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)、單寧酶活力為縱坐標(biāo)繪制菌株產(chǎn)酶曲線，研究酶活力變化情況。

1.2.8 發(fā)酵培養(yǎng)基成分對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響

分別考察發(fā)酵培養(yǎng)基中五倍子渣含量（固形物含量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，20%、40%、60%、80%）、外加氮源（0.5%的蛋白胨、檸檬酸銨、酵母浸膏、硫酸銨、氯化銨、亞硝酸銨、硝酸銨）、外加碳源（1%的葡萄糖、甘露糖、D－果糖、蔗糖、甘油、α－乳糖）對(duì)WC－2菌株產(chǎn)單寧酶的影響：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種WC－2孢子懸浮液，于28 ℃培養(yǎng)96h，測(cè)定單寧酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)單寧酶真菌的篩選

以單寧酸為唯一碳源，從渥堆的黑毛茶中篩選得到5株具有分泌單寧酶活性的真菌（圖1），分別編號(hào)為WC－1～WC－5，其中菌株WC－2的產(chǎn)酶活性最高，經(jīng)菌絲體染色鏡檢，初步鑒定為黑曲霉。

圖1 產(chǎn)單寧酶真菌的篩選Fig.1 Screening of tannase－producing fungi

目前報(bào)道較多的產(chǎn)單寧酶真菌主要來自于黑曲霉，而黑毛茶在渥堆過程中的主要優(yōu)勢(shì)真菌就包括黑曲霉。所以，從黑毛茶中分離出產(chǎn)單寧酶的黑曲霉進(jìn)一步驗(yàn)證了黑曲霉不僅參與黑毛茶的渥堆過程，還可能參與化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和形成。

2.2 發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響（圖2）

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on tannase－producing

由圖2可看出，菌株WC－2在37 ℃固態(tài)發(fā)酵下產(chǎn)生的單寧酶活力最強(qiáng)。這與已報(bào)道過的黑曲霉產(chǎn)單寧酶最佳溫度不一致，可能與該菌株的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。因?yàn)?，在黑毛茶渥堆過程中的溫度往往會(huì)超過50 ℃，使得耐高溫真菌得以存活和生長(zhǎng)。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響（圖3）

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響Fig.3 Effect of fermentation time on tannase－producing

由圖3可看出，單寧酶的活力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降，在72h時(shí)單寧酶的活力達(dá)到最高，為11.64U·g－1。這是因?yàn)?，單寧酶的合成和分泌一般在黑曲霉生長(zhǎng)最旺盛的階段（即發(fā)酵72～120h），隨后單寧酶合成會(huì)減弱，并被蛋白酶所降解。因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為72h。

2.2.3 五倍子渣含量對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響（圖4）

圖4 五倍子渣含量對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響Fig.4 Effect of dallnut dregs content on tannase－producing

由圖4可看出，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中五倍子渣含量的增加，單寧酶活力逐漸升高，在含量為80%時(shí)，酶活力最高達(dá)到13.92U·g－1。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在五倍子渣含量超過80%后，發(fā)酵培養(yǎng)基在高溫滅菌后容易發(fā)生結(jié)塊，不適于固態(tài)發(fā)酵。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中的五倍子渣最佳含量為80%。

2.2.4 外加氮源對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響（圖5）

由圖5可看出，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加無(wú)機(jī)氮源有利于單寧酶的產(chǎn)生，其中以硝酸銨為外加氮源時(shí)所產(chǎn)單寧酶活力達(dá)到19.65U·g－1。因此，選擇最佳外加氮源為硝酸銨，添加量為0.5%。

2.2.5 外加碳源對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響（圖6）

由圖6可看出，添加不同碳源時(shí)，單寧酶的活力大小依次為α－乳糖＞甘露糖＞蔗糖＞D－果糖＞甘油＞葡萄糖，其中α－乳糖的效果最好，酶活力可達(dá)14.60U·g－1。因此，選擇最佳外加碳源為α－乳糖，添加量為1%。

在上述優(yōu)化的發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基組成下，即五倍子渣含量為80%，外加碳源為α－乳糖、添加量1%，外加氮源為硝酸銨、添加量0.5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間72h，單寧酶活力達(dá)到27.06 U·g－1。

圖5 不同外加氮源對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響Fig.5 Effect of different additional nitrogen sources on tannase－producing

圖6 不同外加碳源對(duì)產(chǎn)單寧酶的影響Fig.6 Effect of different additional carbon sources on tannase－producing

3 結(jié)論

采用富含單寧酸的平板培養(yǎng)基對(duì)黑毛茶中產(chǎn)單寧酶的真菌進(jìn)行篩選，經(jīng)純化后初步鑒定該菌為黑曲霉，并對(duì)其中一株黑曲霉WC－2產(chǎn)單寧酶的發(fā)酵條件以及發(fā)酵培養(yǎng)基的組成進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的條件為：五倍子渣含量80%，外加碳源為α－乳糖、添加量1%，外加氮源為硝酸銨、添加量0.5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間72h。在此條件下，單寧酶活力最高達(dá)到27.06 U·g－1。

［1］傅冬和，劉仲華，黃建安，等.茯磚茶加工過程中主要化學(xué)成分的變化［J］.食品科學(xué)，2008，29（2）：64－67.

［2］馬靜，羅龍新.黑茶加工中微生物鑒定研究進(jìn)展［J］.中國(guó)茶葉，2001，（2）：12－13.

［3］張大春，王登良，郭勤.黑茶渥堆作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)茶葉，2002，24（5）：6－8.

［4］溫瓊英，劉素純.黑茶渥堆（堆積發(fā)酵）過程中微生物種群的變化［J］.茶葉科學(xué)，1991，（S1）：10－16.

［5］董坤，熊辛宇，藍(lán)增全.普洱茶發(fā)酵過程中微生物類群分析［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，（1）：164－165.

［6］MUKHERJEE G，BANERJEE R.Biosynthesis of tannase and gallic acid from tannin rich substrates byRhizopusoryzaeandAspergillusfoetidus［J］.Journal of Basic Microbiology，2004，44（1）：42－48.

［7］van DIEPENINGEN A D，DEBETS A J，VARGA J，et al.Efficient degradation of tannic acid by blackAspergillusspecies［J］.Mycological Research，2004，108（8）：919－925.

［8］朱宏濤，楊崇仁，李元，等.普洱茶后發(fā)酵過程中微生物的研究進(jìn)展［J］.云南植物研究，2008，30（6）：718－724.

［9］王志剛，童哲，程蘇云.茯磚茶中霉菌含量和散囊菌鑒定及利弊分析（續(xù)）［J］.食品科學(xué)，1992，（6）：1－4.

［10］溫瓊英.茯磚茶中主要微生物的研究［J］.茶葉通訊，1986，（4）：19－21.

［11］DU Q Z，LI M J，CHENG Q，et al.Purification of（－）－epigallocatechin from enzymatic hydrolyzate of its gallate using high－speed counter－current chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1995，687（1）：174－177.

［12］CAO X L，ITO Y.Preparation and purification of epigallocatechin by high－speed counter－current chromatography（HSCCC）［J］.Journal of Liquid Chromatogrphy Related Technologies，2004，27：145－152.

［13］SHARMA S，BHAT T K，DAWRA R K.A spectrophotometric method for assay of tannase using rhodanine［J］.Analytical Biochemistry，2000，279（1）：85－89.