脲酶測定法判定豆?jié){抗?fàn)I養(yǎng)因子熱失活情況研究

林菁菁，伊娟娟，王振宇，3＊

（1.圣元國際食品營養(yǎng)有限公司；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；3.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

人們把對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用產(chǎn)生不利影響以及使人和動物產(chǎn)生不良生理反應(yīng)的物質(zhì)，統(tǒng)稱為抗?fàn)I養(yǎng)因子（ANF）。大豆及其制品中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，包括蛋白酶抑制因子、脲酶、凝集素、植酸、脂肪氧化酶等，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子嚴(yán)重阻礙了蛋白質(zhì)和其它營養(yǎng)物質(zhì)的有效利用，對食用和飼用價值均產(chǎn)生不利影響。生大豆中胰蛋白酶抑制因子的含量約30mg／g，它對植物本身具有保護(hù)作用，可防止大豆籽粒自身發(fā)生分解代謝，使種子處于休眠狀態(tài)，能調(diào)節(jié)大豆蛋白質(zhì)的合成和分解。但同時，胰蛋白酶抑制劑因子與腸內(nèi)胰蛋白酶結(jié)合后隨糞便排出體外，使腸內(nèi)胰蛋白酶數(shù)量減少，引起胰腺反射性亢進(jìn)，分泌量加大，增加內(nèi)源氮損失，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)含硫氨基酸的耗散性缺乏，造成體內(nèi)氨基酸代謝失調(diào)或不平衡。

生大豆食入后，在胃腸內(nèi)適宜的水分、溫度、pH條件下被激活，激活的脲酶將大豆中部分含氮化合物分解成氨，大量氨的存在會引起機(jī)體氨代謝障礙或中毒。由于脲酶檢測方法較多，檢測比較容易，所以生產(chǎn)上常以“脲酶活性”的大小來表示大豆及大豆制品中抗?fàn)I養(yǎng)因子的破壞程度，將脲酶作為豆粕和其他豆制品毒性甚至營養(yǎng)價值檢測指標(biāo)。

大豆加工中一些物理因素（溫度、時間、壓力、水分和粒度）可影響脲酶滅活程度。就毒性而言，脲酶活性越小越好，但過度加工（主要溫度過高），往往導(dǎo)致賴氨酸、精氨酸、胱氨酸的破壞和蛋氨酸、異亮氨酸的消化率降低，使水溶性氮減少。適當(dāng)?shù)碾迕钢笜?biāo)可成為綜合評價豆粕及其他大豆制品營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。

大豆中60%～80%的磷都是以植酸態(tài)存在。植酸能和飼料中的礦物質(zhì)元素如鐵、鋅、錳等結(jié)合形成難溶的植酸鹽絡(luò)合物，從而導(dǎo)致這些必需礦物質(zhì)元素的消化利用率降低。植酸能與蛋白質(zhì)結(jié)合，降低其溶解性，影響蛋白質(zhì)的生理功能。植酸還可與淀粉酶、胰酶和胃蛋白酶結(jié)合，抑制其活性。

大豆凝集素是一種高親和性的糖蛋白，在動物腸道中不被蛋白酶水解，因此可與小腸壁上皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，從而損壞小腸壁刷狀緣黏膜結(jié)構(gòu)，干擾消化酶的分泌，抑制腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，使蛋白質(zhì)利用率下降，動物生長受阻甚至停滯。另外，凝集素的L-亞單位能特異性的與淋巴細(xì)胞結(jié)合，對腸道產(chǎn)生的IgA具有拮抗作用，對免疫系統(tǒng)有破壞作用。

脂肪氧化酶又稱抗維生素因子，它在大豆蛋白中的含量比較高，約占大豆總蛋白質(zhì)的2%，是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)。該酶只要遇到水分，就能專一催化大豆中多元不飽和脂肪酸（亞油酸、亞麻酸）的加氧反應(yīng)，生成的過氧化物可以破壞與其共存的維生素A、D、E、B12和胡蘿卜素，生成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物，再經(jīng)裂解酶分解生成短碳鏈的醇、酮和醛類等揮發(fā)性物質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)生豆腥味。另外，脂肪氧化酶氧化生成的過氧化物，可破壞脂肪中的維生素A、D、E等脂溶性維生素及胡蘿卜素的活性，從而降低大豆蛋白的效價和營養(yǎng)價值。

豆?jié){作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白飲品一直受到亞洲人的喜愛，但作為大豆制品的豆?jié){會含有一些妨礙營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和利用的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、脲酶、血球凝集素、脹氣因子等。目前對大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子采用的失活方法主要是物理熱處理法。由于豆?jié){中脲酶的測定方法多且較容易，常常通過豆?jié){中脲酶活性的情況來判斷抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在與否。本研究通過測定豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑和脲酶的活性研究豆?jié){加熱過程中二者失活是否具有一致性，判定以脲酶活性來體現(xiàn)豆?jié){安全的科學(xué)性，同時通過豆?jié){加熱程度與胰蛋白酶抑制劑失活情況的關(guān)系，對家庭豆?jié){制作提供一種安全的加熱模式。主要目的是分析以測定脲酶的熱失活是否可以判定或反應(yīng)豆?jié){中其他抗?fàn)I養(yǎng)因子的熱失活情況，同時，尋求家庭自制豆?jié){煮沸的最佳時間以保證飲用安全。

加熱處理對豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑和脲酶失活程度的一致性研究；家庭豆?jié){制作加熱處理方式確定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑的選擇

大豆、牛胰蛋白酶、所用化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備的選擇

LD4-2離心機(jī)、多功能恒溫水浴鍋HHBll-500型、紫外可見分光光度計UV-2401PC型、PHS-3C精密pH計、EST-4電子分析天、電子稱量高速組織搗碎機(jī)

1.3 溶液的配制

Tris緩沖溶液；BAPNA 溶液；0.001NHCl；胰蛋白酶溶液；30%醋酸溶液；硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)貯存液；尿素緩沖溶液（pH6.9至7.0）；25% 三氯乙酸；納氏試劑。

1.4 基本檢測方法

1.4.1 豆?jié){干物質(zhì)含量的測定

豆?jié){干物質(zhì)含量的測定采用重量法（GB／T 8858-1988）。

1.4.2 熱處理對豆?jié){胰蛋白酶抑制劑和脲酶失活程度一致性研究

加熱處理生豆?jié){，分別取加熱至50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的樣品，及煮沸1～6、10、15、20min的樣品，測定加熱前后豆?jié){中脲酶及胰蛋白酶抑制劑的活性及干物質(zhì)含量（%），計算失活率（%）。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液（μmol數(shù)）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)曲線

則吸光度與摩爾數(shù)之間的關(guān)系方程為：y＝0.1488x-0.0275（R2＝0.9931）其中，y為吸光度，x為NH4＋的摩爾數(shù)。由表2可知對于家庭泡發(fā)的生豆?jié){在煮制過程中，隨著加熱溫度的升高，其UA的活性呈遞減趨勢，且加熱溫度越高失活率越大；但在加熱溫度較低時，UA的失活程度并不明顯，待到80℃后，其UA的失活程度急劇升高，90℃時，UA的失活率就已達(dá)到80%，可見脲酶對于熱很不穩(wěn)定，即普通加熱溫度便可使豆?jié){中的脲酶大量失活。在100℃煮沸后，豆?jié){中UA的活性仍隨著時間的延長而降低，其失活程度十分緩慢，煮沸6min后，豆?jié){中脲酶的失活率就將達(dá)到90%，煮沸15min時豆?jié){中的脲酶就完全失活，根據(jù)QB／T2132-1995對豆乳中脲酶的定量檢出量應(yīng)為0mg／g即為合格，說明此時飲用豆?jié){相對安全，而家庭煮豆?jié){一般在所謂開鍋幾分鐘后就飲用，顯然豆?jié){中還會殘存少量脲酶，對健康有一定危害。

對于家庭泡發(fā)的生豆?jié){在煮制過程中，隨著加熱溫度的升高，其TIA的活性呈遞減趨勢，且加熱溫度越高失活率越大；但在未煮沸之前豆?jié){TIA的失活程度尚未達(dá)到一半，其失活水平處于一個很低的狀態(tài)，即此時的豆?jié){具有很高的抗?fàn)I養(yǎng)性，不宜飲用。當(dāng)豆?jié){煮沸1min時，其TIA失活率仍未達(dá)到50%，但隨著加熱時間的延長，其失活程度開始大大加強(qiáng)，3～5min失活率急劇升高，6min時豆?jié){TIA失活率就超過80%，煮沸15min時，即在豆?jié){中脲酶完全失活時胰蛋白酶抑制劑仍保持一定活性，煮沸20min時TIA才完全失去活性，此時飲用豆?jié){才相對安全。

2.2 豆?jié){加熱中TIA和UA的失活情況及比較

根據(jù)試驗測定數(shù)據(jù)使其能更直觀的看出豆?jié){在加熱中TIA和UA的失活情況及二者的較，結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 不同加熱溫度豆?jié){UA、TIA失活情況及比較

圖3 100℃不同加熱時間豆?jié){UA、TIA失活情況及比較

由圖2、3可明顯看出在不同加熱溫度和煮沸時間下豆?jié){中TIA和UA的失活路徑及二者失活情況的比較。豆?jié){中的UA和TIA在加熱過程中均發(fā)生鈍化，且存在一定的線性關(guān)系，但二者的失活路徑不盡相同。

自制生豆?jié){在加熱過程中，隨著加熱溫度的升高其TIA、UA的失活率均呈遞增趨勢。TIA的失活較為平穩(wěn)，而UA從加熱開始到50℃失活率幾乎為0，從60℃到90℃急劇失活；在70℃左右時，豆?jié){中的TIA和UA失活率有一個近似交點，說明此時二者對熱的穩(wěn)定性比較一致，且隨著加熱溫度的升高，UA的失活率明顯大于TIA。

100 ℃煮沸后，隨著時間的遞增，TIA的失活仍有上升趨勢，3～5min失活開始加劇，5min后失活逐漸緩慢；而UA在此段時間內(nèi)失活路徑十分平緩，但最終豆?jié){在煮制后其UA的失活率仍然大于TIA，且在煮沸5min后二者的失活路徑基本一致，在豆?jié){中UA完全失活5min后TIA才完全失活，且要完全去除豆?jié){中的UA和TIA需將豆?jié){煮沸15min和20min。

3 結(jié)論

豆?jié){中的脲酶和胰蛋白酶抑制劑在加熱過程中均發(fā)生鈍化，且存在一定的線性關(guān)系，但二者的失活路徑不盡相同。在大豆加工中，以脲酶作為抗?fàn)I養(yǎng)因子失活指標(biāo)不能全面反映大豆及其制品中抗?fàn)I養(yǎng)因子的失活狀況。且從本研究中還可以得到如下結(jié)論：生豆?jié){高溫加熱是去除TIA最直接有效的方法，且要完全去除豆?jié){中的UA和TIA需將豆?jié){煮沸15和20min。故根據(jù)QB／T2132-1995對豆乳中脲酶的定量檢出量的要求家庭煮制的豆?jié){并非安全，應(yīng)適當(dāng)延長其煮沸時間。

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