miR-222下調(diào)高糖下小鼠系膜細胞TIMP3表達

，， (南華大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南 衡陽 421001)

miR-222下調(diào)高糖下小鼠系膜細胞TIMP3表達

劉應蘭，曹仁賢，楊靖
(南華大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南 衡陽 421001)

目的探討miR-222是否通過靶向調(diào)控TIMP3表達參與糖尿病腎病的發(fā)生過程，從而進一步揭示糖尿病腎病的發(fā)病機制。方法運用qRT-PCR檢測經(jīng)25 mmol/L葡萄糖處理的小鼠系膜細胞(HG組)和對照小鼠系膜細胞(5 mmol/L葡萄糖，NG組)中miR-222和TIMP3的表達；將miR-222 mimics轉染小鼠系膜細胞，以TIMP3 siRNA為陽性對照，采用Western blot檢測其對TIMP3蛋白表達水平的影響。結果qRT-PCR檢測結果顯示，miR-222在經(jīng)高糖處理的小鼠系膜細胞中的表達相對比正常濃度糖處理的小鼠系膜細胞中明顯上調(diào)，而TIMP3在經(jīng)高糖處理的小鼠系膜細胞中mRNA的表達相對比正常濃度糖處理的小鼠系膜細胞中明顯下調(diào)；Western blot結果顯示，過表達miR-222或干擾TIMP3可抑制TIMP3蛋白的表達(P<0.05)。結論miR-222可能通過調(diào)控TIMP3的表達參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

miRNA-222； 糖尿病腎??； 金屬蛋白酶組織抑制因子3

miRNAs是一類高度保守的非編碼小RNA分子，能與靶基因3′非編碼區(qū)特異性結合，在轉錄后水平調(diào)控基因的表達，從而導致靶mRNA降解和翻譯阻遏[1]。miRNAs大約調(diào)控人類三分之一的蛋白編碼基因的表達。miRNAs調(diào)控很多重要的生物學過程，包括發(fā)育、細胞增殖和凋亡、細胞分化、代謝等[2]，并且在很多疾病中表達異常，包括糖尿病。金屬蛋白酶組織抑制因子3(TIMP3)是TIMPs家族成員之一。研究表明，TIMP3多態(tài)性與I型糖尿病腎病的發(fā)病明顯相關[3]，并且TIMP3在人糖尿病腎小球中差異表達[4]。研究表明，miR-222通過調(diào)控TIMP3參與胃癌的發(fā)生發(fā)展[5]。在高糖環(huán)境下，TIMP3在患糖尿病腎病的人和小鼠的腎臟中表達下調(diào)[6]。本研究擬通過采用qRT-PCR、熒光素酶報告系統(tǒng)以及Western blot檢測miR-222是否通過靶向TIMP3參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，為進一步闡明糖尿病腎病的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞處理

SV40 MES 13細胞系小鼠系膜細胞株，由中山大學附屬腫瘤醫(yī)學研究所惠增。SV40 MES 13細胞用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。消化細胞接種于6孔板中，分別用25 mmol/L葡萄糖(HG組)和5 mmol/L葡萄糖(NG組)處理SV40 MES 13細胞48 h。

1.2 主要材料

DMEM培養(yǎng)液購自invitrogen公司；miR-222 mimics與 scramble購自Exiqon公司；TIMP3 siRNA質(zhì)粒購自santa cruz公司；TIMP3抗體和β-actin抗體購自CST公司；Trizol和Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；用于qRT-PCR的引物由invitrogen公司合成；qRT-PCR miRNA和mRNA Detection Kit購自廣州銳博生物技術公司。

1.3 qRT-PCR

采用Trizol法抽提細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。PCR擴增反應為20 μL體系，包括Taq DNA polymerase 5U/μL 0.2 μL，2×SYBR Mix 10 μL，miRNA RT product 2.0 μL，MiR-PCR primers(5 mmol/L)0.4 μL，滅菌蒸餾水7.4 μL。循環(huán)體系為:95°C 3 min,95°C 12 s，62°C 35 s,72°C 30 s,共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，所測定的mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCT法分析。

1.4 Western blot

為了明確miR-222對TIMP3的蛋白質(zhì)表達的調(diào)控，運用將Western blot檢測外源表達miR-222對TIMP3蛋白表達水平的改變。將miR-222 mimics轉染SV40 MES 13細胞，以轉染miR-222-scramble為陰性對照，轉染TIMP3 siRNA為陽性對照，轉染48 h后收集蛋白，并進行蛋白濃度測定。各組取等量樣本，進行SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，加入TIMP3抗體或β-actin抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜，然后加ECL發(fā)光劑，X片曝光、顯影、定影。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 SV40 MES 13小鼠系膜細胞中miR-222和TIMP3表達水平的檢測

qRT-PCR結果顯示，miR-222在高糖環(huán)境下SV40 MES 13細胞中的表達(2-△△CT)為4.173±0.072，在低糖環(huán)境下的SV40 MES 13細胞中的表達(2-△△CT)為0.528±0.132，NG組明顯低于HG組(P<0.05)；TIMP3在高糖環(huán)境下SV40 MES 13細胞中的表達為0.237±0.246，在低糖環(huán)境下的SV40 MES 13細胞中的表達為1.216±0.163，NG組明顯高于HG組(P<0.05)。

2.2 miR-222對TIMP3蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，轉染miR-222組TIMP3和TIMP3 siRNA組蛋白表達水平較陰性對照組明顯降低，提示，在SV40 MES 13小鼠系膜細胞中miR-222能下調(diào)TIMP3蛋白的表達(圖1)。

圖1 Western blot檢測外源表達miR-222對TIMP3蛋白表達的影響

3 討 論

糖尿病腎病(DN)是慢性腎臟疾病的主要病因之一，在很大程度上促使了糖尿病患者的死亡率。從形態(tài)學上，糖尿病腎病主是以腎小管-間質(zhì)纖維化，腎小球基底膜增厚，系膜外基質(zhì)增生，從而導致纖維化，其主要原因是細胞外基質(zhì)(ECM)的積聚所致。而細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)主要受基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)兩者之間的平衡所調(diào)控。TIMP3在腎臟中大多高表達，在小鼠中TIMP3表達缺失與炎癥、腎臟纖維化和腎小管間質(zhì)損傷相關[7-8]。TIMP3也是調(diào)節(jié)組織微環(huán)境包括控制炎癥和纖維化的關鍵因子[8-9]。眾所周知，炎癥在糖尿病腎病的發(fā)病機理中起主導作用[10]，在人類或小鼠模型研究表明，TIMP3表達下調(diào)與糖尿病并發(fā)癥和代謝炎癥明顯相關[11-12]。

TIMPs和MMPs之間的動態(tài)生理平衡決定細胞外基質(zhì)(ECM)和組織微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。研究顯示，TIMP3是TIMPs家族中在腎臟中表達最高的一種[8]，TIMP3在小鼠中表達缺失，表現(xiàn)出對心肌病[13]和腎質(zhì)性腎炎和纖維化[8]的敏感性增高。研究表明，TIMP3表達缺失能加重糖尿病的腎臟損害，主要表現(xiàn)為腎臟的重量增加，腎小球系膜基質(zhì)增厚，尿蛋白排泄增加，而這些都是糖尿病腎病的早期特征[14]。TIMP3是MMP2活性的重要抑制因子[8,15]，在Akita糖尿病的小鼠腎臟中TIMP3表達缺失能導致MMP2的活性增強。

本研究通過qPT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-222在高糖環(huán)境中的小鼠系膜細胞中表達上調(diào)，而TIMP3在高糖環(huán)境中的小鼠系膜細胞中表達下調(diào)。研究已證實TIMP3是miR-222直接調(diào)控的靶基因[16]，本實驗還通過蛋白質(zhì)印跡試驗證實了在小鼠系膜細胞中高表達miR-222能下調(diào)TIMP3蛋白的表達，表明TIMP3表達下調(diào)可能部分是由于miR-222表達上調(diào)所致。綜上所述，本研究通過證實miRNA-222在轉錄后調(diào)控TIMP3的表達，從而參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，為糖尿病腎病發(fā)展的可能分子機制提供了新的觀點，也為其治療提供了新的治療靶點。

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miR-222DownregulatestheExpressionofTIMP3inMouseHighGlucoseMesangialCells

LIU Yinglan,CAO Renxian，YANG Jing
(DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo explicit whether miR-222 involved in diabetic nephropathy progression by targeting TIMP3,thus to reveal molecular mechanism of diabetic nephropathy.MethodsA qRT-PCR was conducted for detect the expression of miR-222 and TIMP3 mRNA in high glucose condition (25 mmol/L glucose) and normal glucose condition (5 mmol/L glucose)in SV40 MES 13 mouse mesangial cells.SV40 MES 13 mouse mesangial cells were transfected with miR-222 mimics,and TIMP3 siRNA as for positivecontrol,Western blot was performed to detect the expressions of TIMP3 protein.ResultsqRT-PCR showed that miR-222 was up-regulated in high glucose condition,however,the mRNA of TIMP3 was down-regulated in high glucose condition.Western blot showed that the expressions of TIMP3 protein was inhibited by transfected with miR-222 or siR TIMP3 in SV40 MES 13 mouse mesangial cells.ConclusionmiR-222 may involvedin diabetic nephropathy progression by regulating TIMP3.

miR-222; diabetic nephropathy; TIMP3

2095-1116(2014)05-0452-03

2014-03-26

劉應蘭，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病的發(fā)病機理，E-mail:42066645@qq.com.

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(此文編輯：朱雯霞)