采用乳桿菌發(fā)酵提高黃帝椒加工品質(zhì)*

劉世源，宗紅，陸信曜，諸葛斌，方慧英，孫進，樓笑笑，馮倩

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物研究室，江蘇無錫，214122)

2(浙江正味食品有限公司，浙江省調(diào)味食品制造工程技術(shù)研究中心，浙江義烏，322000)

黃帝椒(Capsicum chinense)又名黃燈籠椒、黃辣椒，是海南特有的辣椒品種，形狀似燈籠，色澤金黃，肉質(zhì)較厚，辣度極高。黃帝椒具有很好的營養(yǎng)保健功能:其高含量的辣椒素類物質(zhì)可增強食欲，改善血液循環(huán)，具有抗癌、降血壓和減肥等作用［1］;其豐富的抗氧化物質(zhì)如維生素C、谷胱甘肽、總多酚等可清理體內(nèi)多余的自由基和重金屬等有害物質(zhì)，具有抗衰老和預(yù)防癌癥的作用［2］。因新鮮黃帝椒不易保鮮且辣度高，在海南省主要做成黃帝椒醬。黃帝椒醬具有濃郁鮮美的香味，深受嗜辣人群的喜愛。

乳酸菌是發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌。近年來，有很多關(guān)于接種乳酸菌發(fā)酵蔬菜的報道。研究表明，乳酸菌不僅能豐富食品的風(fēng)味，而且能提高其品質(zhì)和營養(yǎng)保健功能，具有抗腫瘤、降低膽固醇和提高免疫力等重要生物學(xué)功能［3］。

目前傳統(tǒng)黃帝椒醬的制作方法是自然腌制，其加工工藝粗放而且會產(chǎn)生危害人體健康的亞硝酸鹽。本研究室在采用PCR-DGGE技術(shù)對部分黃帝椒產(chǎn)品中的微生物進行分離及鑒定的基礎(chǔ)之上［4］，利用所篩選的乳桿菌加工黃帝椒，開發(fā)出了一套乳桿菌發(fā)酵黃帝椒醬的生物加工工藝。為考察乳桿菌加工對黃帝椒醬品質(zhì)的影響，本文對乳桿菌發(fā)酵黃帝椒醬的亞硝酸鹽、抗氧化物質(zhì)及活性、有機酸和氨基酸等進行了分析，為黃帝椒生物加工產(chǎn)品品質(zhì)的提高打下基礎(chǔ)，同時為其他椒類的功能化生物加工提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

新鮮黃帝椒“熱辣2號”雜交種，產(chǎn)地海南陵水;

Lactobacillus plantarum E2，Lactobacillus plantarum M1和Lactobacillus brevis M2由本研究中心篩選保藏。

主要試劑:鹽酸荼乙二胺、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、3，5-二硝基水楊酸、焦性沒食子酸、酒石酸亞鐵、Na2HPO4、KH2PO4、DPPH、鐵氰化鉀、三氯乙酸、水楊酸、FeSO4·7H2O、鄰苯三酚、PITC、醋酸鈉均為分析純，甲醇、乙腈為色譜純。

MRS培養(yǎng)基(g/L)配方:牛肉膏 10，蛋白胨 10，酵母粉 5，K2HPO42，檸檬酸銨 2，乙酸鈉 5，葡萄糖20，吐溫 80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，pH6.2～6.4，固體培養(yǎng)基加20 g瓊脂。

MP5002電子天平，上海天平儀器廠;立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司;生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;WK－200B高速組織粉碎機，青州市精誠機械有限公司;可見光分光光度計WFJ7200 Unic，上海儀器有限公司;高效液相色譜儀，美國戴安公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵菌液的制備

分別將菌種L.plantarum E2，L.plantarum M1和L.brevis M2接種于固體MRS培養(yǎng)基活化，然后轉(zhuǎn)接于液體MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)12～20 h，離心，用生理鹽水洗滌并調(diào)整菌濃為109CFU/mL，作為發(fā)酵菌液。

1.2.2 黃帝椒醬的加工工藝

新鮮黃帝椒清洗后瀝干水分，切成0.5 mm×0.5 mm左右的丁狀，加20%水，分別接入等量的3%發(fā)酵菌液(樣品A接菌:L.plantarum E2、L.plantarum M1和L.brevis M2三菌等比例混合，樣品 B接菌:L.plantarum E2和 L.plantarum M1兩菌等比例混合)。混勻后裝壇，密封，置于25℃發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，加入12%的食鹽，混勻，PE瓶包裝，置于30℃貯藏。10 d后取樣測定，每個處理做3個重復(fù)。其中，不接菌的自然腌制樣品作為空白對照。

1.2.3 測定方法

亞硝酸鹽的測定:采用鹽酸荼乙二胺法測定，方法參考GB 5009.33－2010。

總多酚含量的測定:采用Folin-Ciocalteu比色法測定［5］。

抗氧化活性的測定:清除DPPH·和鐵還原能力的測定方法參考文獻［6］，清除超氧陰離子(O2－·)能力和在水楊酸體系中清除羥基自由基(·OH)能力的測定方法參考文獻［7］。

有機酸的測定:采用高效液相色譜法［8］。

氨基酸和還原型谷胱甘肽的測定:采用高效液相色譜法測定［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳桿菌對黃帝椒醬亞硝酸鹽的降解

腌制食品中會產(chǎn)生一定量的亞硝酸鹽，亞硝酸鹽具有一定毒性且是強致癌物質(zhì)。對不同黃帝椒醬樣品中的亞硝酸鹽含量變化測定結(jié)果如圖1。

圖1 不同黃帝椒醬樣品亞硝酸鹽含量的變化Fig.1 Changes of nitrite in different samples of Capsicum chinense sauce

由圖1可見，自然腌制樣品的亞硝酸鹽含量在第4 d達到最高，為2.86 mg/kg，之后開始下降。黃帝椒經(jīng)乳桿菌發(fā)酵后，其亞硝酸鹽含量顯著降低。在第10天，樣品A和B的亞硝酸鹽含量均降到0.2 mg/kg以下，與自然腌制樣品相比，分別降低了93.3%、91.2%，亞硝酸鹽基本被消除。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，使環(huán)境pH迅速降低，在H+的作用下NO2－被還原，同時，低 pH可抑制硝酸鹽還原菌的生長［10］。由此可見，所用乳桿菌均有很強的亞硝酸鹽降解能力。

2.2 乳桿菌加工黃帝椒醬抗氧化活性及抗氧化成分分析

2.2.1 乳桿菌加工黃帝椒醬抗氧化活性的分析

清除DPPH·、O2－·、·OH的能力和對鐵的還原能力是衡量物質(zhì)抗氧化活性的常用指標(biāo)。對不同黃帝椒醬樣品進行抗氧化活性的測定，結(jié)果見圖2。

由圖2黃帝椒醬的抗氧化活性指標(biāo)可以看出，與自然腌制樣品相比，樣品A的清除DPPH·、清除O2

－·、清除·OH的能力和對鐵的還原能力分別提高了約59.2%、55.3%、53.7%和82.1%，略高于樣品B的抗氧化活性。乳酸菌具有抗氧化活性，其抗氧化機理包括乳酸菌的還原活性、活性氧的清除等［11］。乳桿菌發(fā)酵黃帝椒會產(chǎn)生一些抗氧化活性物質(zhì)，從而提高了黃帝椒醬的抗氧化活性。

2.2.2 抗氧化成分總多酚和還原型谷胱甘肽含量的分析

植物多酚包括單寧類、酚酸類和黃酮類等［12］，具有重要的抗氧化作用，可清理體內(nèi)多余的自由基，抗衰老和預(yù)防癌癥的發(fā)生［2］。對不同黃帝椒醬樣品中總多酚進行測定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，與自然腌制樣品相比，樣品A和樣品B的總多酚含量分別提高了59.7%和51.3%。乳酸菌在利用黃帝椒發(fā)酵的過程中，代謝途徑可能涉及到合成多酚類的醋酸-檸檬酸及莽草酸復(fù)合途徑［12］，在產(chǎn)生有機酸的同時也產(chǎn)生了多酚類物質(zhì)。這與王秀娟等人在利用乳酸菌發(fā)酵綠茶的研究中提高了茶多酚含量的結(jié)果相一致［13］。另外，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，降低了環(huán)境 pH，抑制了黃帝椒多酚氧化酶的活性［14］，從而抑制了多酚類物質(zhì)的氧化。因此，乳桿菌提高了黃帝椒醬中的抗氧化成分總多酚的含量。

還原型谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的三肽，具有多種生理保健作用，如抗氧化、增強免疫力、延緩衰老、整合解毒和抗腫瘤等作用。此外，GSH在與脫氨酸、L-谷氨酸鈉等物質(zhì)共存并發(fā)生反應(yīng)的情況下，能夠產(chǎn)生特有的風(fēng)

圖2 不同黃帝椒醬樣品的抗氧化活性的分析Fig.2 Analysis of antioxidant capacity in different samples of Capsicum chinense sauce

圖3 不同黃帝椒醬樣品總多酚含量的分析Fig.3 Analysis of total polyphenolin different samples of Capsicum chinense sauce

圖4 不同黃帝椒醬樣品GSH含量的分析Fig.4 Analysis of GSH in different samples of Capsicum chinense sauce

味物質(zhì)，提高產(chǎn)品的風(fēng)味。利用高效液相色譜對不同 黃帝椒醬樣品中的GSH進行測定，結(jié)果見圖4。GSH含量分別提高了67.1%、58.8%。在發(fā)酵黃帝椒的過程中，乳桿菌利用自身復(fù)雜的蛋白酶系分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生各種氨基酸，其中的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸等經(jīng)一系列代謝和谷胱甘肽還原酶的作用下生成GSH［15－17］。由此可見，乳桿菌可顯著提高黃帝椒醬中的抗氧化成分還原型谷胱甘肽的含量。

2.3 乳桿菌加工黃帝椒醬有機酸含量的分析

利用高效液相色譜對不同黃帝椒醬樣品中的有機酸進行分析，結(jié)果如圖5。

圖5 不同黃帝椒醬樣品有機酸含量的分析Fig.5 Analysis of organic acids in different samples of Capsicum chinense sauce

由圖5可以看出，與自然腌制樣品相比，接種乳桿菌的兩樣品中蘋果酸、琥珀酸、丙酸含量稍有增加，乳酸、乙酸含量增加顯著，其中乳酸含量分別提高了1.9、2.5倍。與樣品B相比，樣品A中的乳酸較少，乙酸較多?？赡苁怯捎跇悠?B的發(fā)酵菌種L.plantarum E2和M1通過EMP途徑進行同型乳酸發(fā)酵，代謝產(chǎn)物主要為乳酸;而樣品A中的L.brevis M2通過PK、HK途徑進行異型乳酸發(fā)酵，除產(chǎn)生乳酸外，還產(chǎn)生乙酸、乙醇和CO2等［18］。因此，在接等量菌種的情況下，樣品B中乳酸含量稍高于樣品A。由此可見，乳桿菌使黃帝椒醬中的有機酸含量增加，這不僅豐富了產(chǎn)品的風(fēng)味而且增強了其生理保健作用。

2.4 乳桿菌加工黃帝椒醬氨基酸含量分析

2.4.1 γ-氨基丁酸含量變化分析

γ-氨基丁酸(GABA)是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它參與多種代謝活動，具有很高的生理活性，如抗焦慮，抗衰老，降血壓，改善睡眠，調(diào)節(jié)激素分泌及神經(jīng)營養(yǎng)等［19］。對黃帝椒醬樣品中的γ-氨基丁酸的測定結(jié)果見圖6。

圖6 不同黃帝椒醬樣品GABA含量的分析Fig.6 Analysis of GABA in different samples of Capsicum chinense sauce

由圖6看出，與自然腌制樣品相比，樣品A和樣品B的GABA含量分別提高了69.7%和54.2%。發(fā)酵樣品的GABA含量提高可能是因為乳酸菌在發(fā)酵過程中利用糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，造成較低的pH環(huán)境，谷氨酸脫羧酶的活性在低pH下(＜5.5)得到激發(fā)，催化谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸［20］。由此可見，乳桿菌發(fā)酵提高了黃帝椒醬的GABA含量，使黃帝椒醬具有很高的生理保健功能。

2.4.2 其他氨基酸含量變化分析

氨基酸不僅是食品中的主要風(fēng)味物質(zhì)，而且是人體重要的生理活性物質(zhì)，利用高效液相色譜對不同黃帝椒醬樣品中的氨基酸進行分析，結(jié)果如圖7。

由圖7可以看出，與自然腌制樣品相比，兩發(fā)酵樣品中的氨基酸含量均有不同程度的提高。其中具有保護心肌、增強肝臟功能和消除疲勞作用的天門冬氨酸(Asp)含量提高了2倍以上，人體必需的色氨酸(Trp)含量提高了1倍以上;呈鮮味的谷氨酸(Glu)含量提高了1倍左右?？梢?，乳桿菌加工提高了黃帝椒醬中的氨基酸含量，在豐富產(chǎn)品風(fēng)味的同時又增強了產(chǎn)品的營養(yǎng)保健功能。

圖7 不同黃帝椒醬樣品的氨基酸含量的分析Fig.7 Analysis of amino acids in different samples of Capsicum chinense sauce

3 結(jié)論

本文對黃帝椒醬的亞硝酸鹽、抗氧化活性及成分、有機酸和氨基酸進行了對比分析。研究發(fā)現(xiàn)，與自然腌制樣品相比，乳桿菌發(fā)酵黃帝椒醬樣品中的亞硝酸鹽基本被消除，抗氧化活性提高了54% ～82%，總多酚、還原型谷胱甘肽(GSH)的含量分別提高了51%、59%以上;主要風(fēng)味物質(zhì)有機酸，特別是乳酸含量提高了2倍;具有呈味作用和生理活性功能的氨基酸含量均有所提高，其中γ-氨基丁酸(GABA)提高了54%以上，天門冬氨酸(Asp)和色氨酸(Trp)分別提高了2倍和1倍以上，鮮味氨基酸谷氨酸(Glu)提高了1倍左右。同時發(fā)現(xiàn)，兩種不同接菌組合的樣品A和樣品B的相關(guān)指標(biāo)無明顯差異。結(jié)果表明，乳桿菌發(fā)酵不僅防止了黃帝椒醬的褐變、軟化［14］，還提高了黃帝椒醬的風(fēng)味、增強了其營養(yǎng)保健功能，為開發(fā)高品質(zhì)且具有營養(yǎng)保健功能的黃帝椒制品提供了依據(jù)。

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