單甲氧基聚乙二醇-醛對草酸脫羧酶的修飾*

韋成昱，林日輝，黃文勤，龍寒，禤金彩，田衛(wèi)滿

1(廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧，530006)

2(南寧奕德環(huán)境科技有限公司，廣西 南寧，530007)3(廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧，530006)

草酸(HOOC—COOH)以草酸鹽的形式廣泛分布于植物、微生物及人在內(nèi)的生物體中。人體內(nèi)沒有降解草酸鹽的相關(guān)酶［1］，人們在食用一些高草酸含量的食物如菠菜，莧菜，柿子，草莓或啤酒等［2］容易導(dǎo)致草酸根(C2O42－)在體內(nèi)積累，從而引發(fā)如腎結(jié)石、泌尿結(jié)石、高草酸尿、低血鈣癥等多種病理狀態(tài)［3］。草酸脫羧酶(EC 4.1.1.2)催化草酸脫羧為甲酸和CO2［4］，是植物、微生物中草酸代謝的主要催化酶之一。研究表明，Oxdc可作為酶制劑降解體內(nèi)的草酸鹽［5］，達(dá)到治療或預(yù)防結(jié)石病的效果。但Oxdc用于消化道內(nèi)降解草酸，容易受胃酸、蛋白酶消化的影響，被消化而失去活性。為了改善Oxdc的使用性能，對其進(jìn)行化學(xué)修飾是一種有效手段。

聚乙二醇(PEG)是一種pH中性，無毒，水溶性較高的聚醚化合物，呈線性結(jié)構(gòu)，常用于修飾藥物蛋白，以保護(hù)藥物分子延長其作用半衰期［6］。經(jīng)過活化的PEG可與酶蛋白的非必需基團(tuán)(氨基、巰基和羧基等)共價(jià)結(jié)合，蛋白表面形成一個PEG保護(hù)層，可作為一種屏障擋住蛋白分子表面的抗原決定簇，抑制免疫反應(yīng)的產(chǎn)生;同時，PEG保護(hù)層保護(hù)了蛋白分子上的敏感鍵，使其免受體內(nèi)水解酶的消化，提高其抗酶水解的能力，從而延長其半衰期。但PEG的修飾位點(diǎn)不均一，形成的產(chǎn)物是個復(fù)雜的混合物，給分離純化帶來很大困難。

單甲氧基聚乙二醇(mPEG)是PEG的衍生物，其性質(zhì)與PEG相似，用甲基封閉一端的活性羥基，可以減少或避免修飾反應(yīng)時發(fā)生交聯(lián)或團(tuán)聚現(xiàn)象，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽、酶分子的修飾。Kinster等［7］用mPEG-丙醛進(jìn)行細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等的PEG化發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下(pH 5.0)，醛與α-氨基的耦合具有高選擇性。采用溫和的mPEG-醛(mPEGALD)修飾劑，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的N末端α-氨基的選擇性修飾［8］。通過mPEG修飾，可以改變酶或蛋白的相關(guān)生物學(xué)特性，例如改變疏水性及電荷，增加酶蛋白的分子質(zhì)量，提高了酶蛋白的穩(wěn)定性、水溶性，減小其免疫原性等。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK(本實(shí)驗(yàn)室保存);LB培養(yǎng)基組成:1 L培養(yǎng)基含蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g;LB固體培養(yǎng)基添加18 g瓊脂粉。

mPEG5000、草酸鉀、甲酸脫氫酶，購自Sigma公司;氨芐青霉素，美國Amresco公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，Merck公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD)，瑞士Roche公司;胰蛋白酶，上海生工進(jìn)口分裝;二甲基亞砜(DMSO)、氫化鈣、氯仿、乙醚、PEG20000、甘氨酸、高碘酸鈉、咪唑、甲酸鈉、檸檬酸、NaHPO4、NaH2PO4、K2HPO4、MnCl2，均為國產(chǎn)分析純。

HisTrap HP親和柱，凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂;快速蛋白液相色譜系統(tǒng)，美國通用;TU-1901紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器;CR-22G高速冷凍離心機(jī)，日本日立;Sigma 1－13高速臺式離心機(jī)，美國Sigma;超低溫冰箱，美國Beckman;4℃冰箱，中國海爾;JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Oxdc的制備及酶活檢測

Oxdc的誘導(dǎo)表達(dá)參考文獻(xiàn)方法［9］，培養(yǎng)發(fā)酵基因工程菌 E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK，添加0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Oxdc，粗酶液用快速蛋白液相色譜系統(tǒng)AKTA-FPLC進(jìn)行純化。

Oxdc的酶活力測定參考Drazzenka S等人的方法［10］。酶活單位定義為:每分鐘催化轉(zhuǎn)化草酸產(chǎn)生1μmol甲酸的酶量。

蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)測得純化酶活力為8.52 U/mL，蛋白質(zhì)含量為1.87 mg/mL。

1.2.2 mPEG-ALD的制備

mPEG 的活化參照 Harris［11］的方法，稱1 g mPEG溶解于1.5 mL氯仿，按照醋酸酐/mPEG摩爾比20∶1加入醋酸酐，并添加經(jīng)干燥處理的DMSO 6 mL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)9 h后，將反應(yīng)溶液逐滴加入4倍體積的冰乙醚，高速攪拌。過濾收集沉淀并用3 mL氯仿溶解，用冰乙醚再次沉淀，重復(fù)3次。將沉淀于室溫真空干燥24 h，即可獲得活化的mPEG-ALD。

取干燥的mPEG5000及其活化產(chǎn)物適量與定量KBr混合，研磨壓片后用傅立葉紅外光譜儀掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活化的mPEG在1 735.62 cm－1出現(xiàn)了C O鍵［15］的特征振動伸縮峰，而未活化的mPEG在此位置未出峰，說明mPEG的羥基被成功活化形成醛基。

活化率測定根據(jù)Schiff試劑能與醛發(fā)生顯色反應(yīng)，在560 nm處有特征光吸收，測定560 nm處的吸光度值，制得吸光度值與戊二醛濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可換算得到產(chǎn)品的醛化率［12］。

經(jīng)檢測，mPEG活化率為63.02%。

1.2.3 Oxdc的mPEG-ALD修飾

［13］，將mPEG-ALD和Oxdc按摩爾比10∶1～150∶1溶于 PBS(pH 4.0 ～9.0)，4 ～45 ℃攪拌反應(yīng)2～24 h后加入過量甘氨酸終止反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物裝入截留分子質(zhì)量8 000－14 000的透析袋，先使用PBS透析除去甘氨酸、殘余mPEG等雜質(zhì)，然后使用30%(w/v)的PEG20000溶液濃縮12 h，所得溶液作為供試酶液。

修飾率的測定采用TNBS法［14］，TNBS與蛋白質(zhì)分子上的游離氨基發(fā)生顯色反應(yīng)，在420 nm處有特征光吸收。野生酶在420 nm的光吸收值記為A0，修飾酶的光吸收值記為A1，按下式計(jì)算修飾率:MR=1－(A1×C0)/(A0×C1)。其中 C0、C1分別為修飾前野生酶的濃度及修飾后經(jīng)透析濃縮所得酶的濃度。(每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個平行，取平均值計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果。)

1.2.4 紅外光譜分析

用KBr壓片法對活化的 mPEG5000、Oxdc及mPEG-Oxdc進(jìn)行紅外光譜掃描，分析其結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.5 SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE電泳分析Oxdc和mPEG-Oxdc，分析其分子質(zhì)量的變化。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.6.1 最適pH值

在 pH 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0 的不同磷酸鹽緩沖體系中分別測定Oxdc和mPEG-Oxdc的酶活力，每個pH設(shè)計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)，以活性最高數(shù)據(jù)為100%酶活力，取平均值計(jì)算相對酶活。

1.2.6.2 溫度對酶活的影響

(1)分別將Oxdc和mPEG-Oxdc在65℃條件下水浴，設(shè)計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)，每30 min取樣測定平均酶活。

(2)分別將 Oxdc 和 mPEG-Oxdc 在 45、50、55、60、65、70、75 ℃條件下熱處理 30 min，每個溫度設(shè)計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)，取樣測定平均酶活，觀察熱處理后酶活力的變化。

1.2.6.3 對胰蛋白酶的耐受性

分別取4.5 mL的Oxdc和mPEG-Oxdc，加入2.5 g/L的胰蛋白酶溶液0.5 mL，37℃水浴，定時取樣檢測殘余酶活，分析胰蛋白酶消化對Oxdc和mPEG-Oxdc的影響(設(shè)計(jì)3組平行實(shí)驗(yàn)，以起始活性數(shù)據(jù)為100%酶活力，取平均值計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果。)。

2 結(jié)果與分析

2.1 mPEG-ALD修飾Oxdc的條件優(yōu)化

2.1.1 mPEG-ALD/Oxdc摩爾比

不同摩爾比的mPEG-ALD/Oxdc對修飾反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1。當(dāng)mPEG-ALD/Oxdc摩爾比為50∶1時，修飾率為39.12%，酶活保留78.29%。但摩爾比超過50∶1時，修飾率及酶活都隨之增加而顯著下降。推測由于mPEG濃度過高，會造成一定的空間位阻而影響酶的活性［16］，此結(jié)果與 Ikeda［17］等人的研究結(jié)果相似，因此選擇mPEG-ALD/Oxdc摩爾比為50∶1進(jìn)行修飾反應(yīng)較適宜。

圖1 mPEG-ALD/Oxdc摩爾比的影響Fig.1 Influence of molar ratio of mPEG-ALD/Oxdc

2.1.2 反應(yīng)pH值

在不同的pH值條件下mPEG修飾的結(jié)果如圖2。由圖可知，在 pH 4.0～8.0時，隨著pH值的增大酶活增大，當(dāng) pH為 5.0時，達(dá)到最高修飾率為49.3%，且保留了67.12%的酶活;在pH為8.0時，酶活回收率達(dá)到最大為80.03%，但修飾率僅為7%。在pH9.0時，酶活和修飾率均降低。這是由于Oxdc的等電點(diǎn)在5.0附近［18］，當(dāng)pH＜5.0時，酶蛋白上的自由氨基形成銨鹽，失去反應(yīng)活性;當(dāng)pH過大時，mPEG-ALD發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)，使醛基含量降低而影響修飾反應(yīng)。因此，修飾反應(yīng)的最適pH為5.0。

圖2 反應(yīng)pH的影響Fig.2 Influence of reaction pH

2.1.3 反應(yīng)溫度

由圖3可知，在4～45℃修飾率隨溫度的升高有一定程度的提高，但酶活隨之有部分損失。當(dāng)修飾溫度為45℃時，修飾率達(dá)到最大為56.98%，但酶活損失接近60%;而37℃時修飾率為39.02%，且酶活保留67.21%。故應(yīng)當(dāng)選擇具有較高修飾率并且保留較高酶活的37℃進(jìn)行修飾。

圖3 反應(yīng)溫度的影響Fig.3 Influence of reaction temperature

2.1.4 反應(yīng)時間

比較2～24 h修飾時間對mPEG修飾Oxdc的影響，發(fā)現(xiàn)修飾率隨修飾時間的增加而增加，但酶活隨之下降，該結(jié)果與劉恩岐［19］等利用mPEG修飾生姜蛋白酶的研究結(jié)果相似。當(dāng)修飾12 h時，修飾率為27.33%，酶活保留61.47%;而繼續(xù)修飾達(dá)24 h時，修飾率為42.95%，但酶活回收比12 h時降低55.2%，僅為27.52%。由此可見，修飾反應(yīng)過度反而會大幅度降低酶活回收率，因此最適修飾時間為12 h。結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)時間的影響Fig.4 Influence of reaction time

2.2 IR分析結(jié)果

圖5 為Oxdc、mPEG-Oxdc與mPEG-ALD的紅外光譜掃描圖。由圖 5(a)和(b)可知，修飾酶在1 636.27 cm－1出現(xiàn)一個C N 鍵［20］的特性吸收峰，而野生酶在此位置不出峰，說明Oxdc的游離氨基與mPEG-ALD的醛基成功共價(jià)結(jié)合形成Schiff base結(jié)構(gòu)。同時，mPEG-Oxdc與 mPEG-ALD在1 100 cm－1附近都出現(xiàn)明顯的C—O—C特征峰［21］，證明 Oxdc與mPEG成功結(jié)合。

2.3 SDS-PAGE分析

圖5 紅外光譜掃描結(jié)果Fig.5 The results of infrared spectrum scanning

SDS-PAGE結(jié)果如圖6所示，Oxdc亞基的分子質(zhì)量約為42 Da。根據(jù)mPEG5000修飾產(chǎn)物的條帶譜型，可推算大概得到了2個修飾酶，分子質(zhì)量分別約為57、67 Da，因此這2個修飾酶分別耦聯(lián)了約3、5個的 mPEG-ALD。此 結(jié) 果 與 楊 清 媛［22］等 人 用mPEG5000修飾超氧化物歧化酶的研究結(jié)果相似。

圖6 SDS-PAGE結(jié)果Fig.6 The results of SDS-PAGE

2.4 部分酶學(xué)性質(zhì)的比較

2.4.1 pH適應(yīng)性

Oxdc和mPEG-Oxdc的在pH 3.5條件下測得酶活最高，因此兩者最適反應(yīng)pH值均為3.5，且在pH 2.0～pH 6.0酸性環(huán)境下mPEG-Oxdc的相對酶活均高于Oxdc，在pH 2.5時Oxdc剩下13.6%的相對酶活，而mPEG-Oxdc仍保持33.6%的相對酶活，說明mPEG-Oxdc的耐酸性比修飾前略有增強(qiáng)。見圖7。

2.4.2 溫度對酶活的影響

65℃水浴0.5 h Oxdc和mPEG-Oxdc均保持80%左右的相對酶活，但熱處理1 h Oxdc相對酶活下降到31.8%，但mPEG-Oxdc仍保留70.9%的酶活。熱處理2 h，mPEG-Oxdc的相對酶活保持50%以上，而Oxdc的相對酶活僅為8.2%，繼續(xù)加熱，Oxdc的酶活基本喪失，可見經(jīng)mPEG修飾的草酸脫羧酶熱穩(wěn)定性顯著提高。見圖8(a)。

圖7 pH的適應(yīng)性Fig.7 The adaptability of pH

Oxdc在70℃熱處理30min后酶活完全消失，而mPEG-Oxdc仍殘余酶活 17.1%，且 75℃熱處理30min相對酶活仍保留10%以上，在熱處理的任何時段內(nèi)，mPEG-Oxdc保持的相對活力均高于Oxdc。推測醛基化修飾酶分子能穩(wěn)定酶的亞基，有效維系酶的剛性，提高酶在極端環(huán)境中的催化活力和熱穩(wěn)定性［23］。見圖8(b)。

圖8 溫度對酶活的影響Fig.8 The effects of temperature to enzymatic activity

2.4.3 對胰蛋白酶的耐受性

經(jīng)過修飾的mPEG-Oxdc對胰蛋白酶消化的耐受能力顯著提高，胰蛋白酶處理24 h后，Oxdc相對酶活僅為20.6%，而mPEG-Oxdc保持47.1%。推測是mPEG與酶共價(jià)結(jié)合形成PEG保護(hù)層，覆蓋了胰蛋白酶對 Oxdc的作用位點(diǎn)［24］，提高其抗酶水解的能力。見圖9。

圖9 對胰蛋白酶的耐受性Fig.9 The tolerability to trypsin

3 結(jié)論

對蛋白質(zhì)或酶修飾的研究，國外最早始于20世紀(jì)70年代，我國從1980年開始對該領(lǐng)域進(jìn)行研究。PEG及其衍生物作為一種應(yīng)用較多的修飾劑，具有無免疫原性，與生物體的相容性好等特點(diǎn)，利用其對蛋白質(zhì)及酶進(jìn)行修飾，可以解決酶和蛋白質(zhì)類等在應(yīng)用過程中存在的諸多問題［25］。本文采用DMSO氧化活化mPEG5000對Oxdc進(jìn)行修飾，并對修飾條件進(jìn)行初步優(yōu)化，最佳條件為mPEG-ALD/Oxdc摩爾比50∶1，pH5.0，37 ℃ 修飾 12 h，此條件下的修飾率為50.69%，酶活殘余67.52%;SDS-PAGE條帶譜表明，Oxdc結(jié)合了3個或5個mPEG5000;IR的結(jié)果證明mPEG與Oxdc成功共價(jià)結(jié)合。酶學(xué)性質(zhì)的分析表明，mPEG不會引起蛋白質(zhì)內(nèi)部分子構(gòu)型的改變，因此對修飾的Oxdc的最適pH值不會造成太大影響，因此mPEG-Oxdc和Oxdc的最適pH值均為3.5。但mPEG與Oxdc共價(jià)交聯(lián)后，在酶分子表面形成緩沖保護(hù)層，維持了酶活性部位微環(huán)境的相對穩(wěn)定，增強(qiáng)了酶天然構(gòu)象的剛性，使Oxdc對酸、熱及胰蛋白酶消化等的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。

本研究采用mPEG修飾酶或蛋白質(zhì)的方法具有反應(yīng)條件溫和，選擇性高的突出優(yōu)點(diǎn)，為草酸脫羧酶的應(yīng)用性研究奠定了基礎(chǔ)。

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