體外產(chǎn)氣法研究棉酚對(duì)瘤胃發(fā)酵與微生物蛋白產(chǎn)量的影響

張力莉，徐曉鋒

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

全棉籽由于具有較均衡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成，在奶牛生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，但無(wú)論是棉籽餅粕還是全棉籽顆粒，在應(yīng)用過(guò)程中都存在棉酚的毒性問(wèn)題，會(huì)對(duì)奶牛造成一定的抗?fàn)I養(yǎng)作用。本研究通過(guò)體外產(chǎn)氣法研究棉酚添加對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料 苜蓿作為體外產(chǎn)氣發(fā)酵飼料，產(chǎn)自寧夏。苜蓿樣品在60℃條件下經(jīng)48 h烘干，粉碎通過(guò)1 mm篩，棉酚購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 緩沖液配制 每升緩沖液中含Na2HPO41.43 g、KH2PO41.55 g、NaHCO38.75 g、NH4HCO31.00 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、CaCl2·2H2O 3.3 g、MnCl2·4H2O 2.5 g、FeCl2·6H2O 0.2 g、CoCl2·6H2O 0.25 g、Na2S9·H2O 0.37g。

1.2.2 瘤胃液的采集 收集3只裝有永久瘤胃瘺管綿羊的瘤胃液。綿羊飼養(yǎng)水平為1.2倍維持水平，日糧精粗比為30∶70，瘤胃液采集時(shí)間為早晨飼喂前0.5 h，采集的瘤胃液立即放入保溫瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.3 混合培養(yǎng)液的配制 收集的瘤胃液用四層紗布過(guò)濾，持續(xù)充入CO2氣體5 min，與緩沖液的配比為1∶2，然后迅速轉(zhuǎn)移至已預(yù)熱好并通有CO2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（1 000 mL），保持在39℃水浴中，并混合。200 mg的苜蓿加入到注射器，然后向注射器注入30 mL緩沖瘤胃液，再將1 mL棉酚溶液通過(guò)硅膠管注射到注射器 （棉酚濃度分別為0.005、0.01、0.05 mg/mL）。即注射器內(nèi)棉酚添加到苜蓿中的濃度為0.025、0.05、0.25 mg/kg。 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 產(chǎn)氣量的測(cè)定 從產(chǎn)氣開始后，分別于3、6、9、12、24、48、72、96 h 通過(guò)玻璃注射器記錄一次產(chǎn)氣量。

1.3 產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)指標(biāo)計(jì)算 參照Φrskov和Mc-Donald（1979）的產(chǎn)氣模型公式將樣品在 3、6、9、12、24、48、72、96 h 的產(chǎn)氣量代入， 應(yīng)用 Neway curve-fitting程序（麥考利土地利用研究所，2004）計(jì)算消化動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Menke和 Steingas，1988）。

1.4 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定 在培養(yǎng)24 h時(shí)，每個(gè)處理組的3個(gè)注射器從培養(yǎng)箱中取出，記錄產(chǎn)氣量，將注射器的內(nèi)容物定量轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，并離心分離。收集上清液于-80℃貯存，用于氨氮、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的分析。沉淀物進(jìn)行冷凍干燥、稱重并分析微生物嘌呤。約1 g干物質(zhì)含量的苜蓿培養(yǎng)在125 mL的燒瓶中，加入90 mL緩沖瘤胃液，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)24 h時(shí)，將燒瓶置于4℃溫度下停止發(fā)酵，并通過(guò)尼龍袋（100～160 μm）過(guò)濾，用于測(cè)定干物質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維瘤胃降解率（Dario等，2003）。

1.5 化學(xué)分析 干物質(zhì)和粗灰分的測(cè)定參照AOAC（1990）。中性洗滌劑纖維、酸性洗滌纖維測(cè)定參照Van Soest（1991）的方法進(jìn)行測(cè)定。揮發(fā)性脂肪酸測(cè)定參照Getachew等（2001）的方法。NH3-N濃度的測(cè)定應(yīng)用比色方法（Weatherburn，1967）。 微生物蛋白（MCP）測(cè)定應(yīng)用嘌呤堿基法（Zinn 和 Owens，1986）。

1.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)運(yùn)用excel 2003進(jìn)行初步處理，運(yùn)用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉酚對(duì)瘤胃產(chǎn)氣參數(shù)的影響 從表1可知，添加棉酚顯著抑制了瘤胃發(fā)酵，產(chǎn)氣量呈顯著下降趨勢(shì)，各處理組較未添加組分別降低5.95%、9.48%、18.37%（P＜0.05）；棉酚添加提高了產(chǎn)氣延遲時(shí)間（P ＜ 0.05），但添加組間差異不顯著（P ＞ 0.05）。

2.2 棉酚對(duì)體外培養(yǎng)瘤胃降解率的影響 從表2可以看出，隨著棉酚添加濃度的提高，體外干物質(zhì)降解率呈下降趨勢(shì)，差異顯著（P＜0.05），但添加量為0.025 mg/kg與0.05 mg/kg的兩組間干物質(zhì)降解率差異不顯著（P＞0.05）。隨著棉酚添加濃度的提高，體外中性洗滌纖維降解率呈現(xiàn)出與干物質(zhì)降解率相同的變化趨勢(shì)，體外酸性洗滌纖維降解率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且組間差異顯著（P＜0.05）。

表1 棉酚對(duì)瘤胃產(chǎn)氣參數(shù)的影響

表2 棉酚對(duì)體外培養(yǎng)瘤胃干物質(zhì)、粗纖維降解率的影響

2.3 棉酚對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表3可知，棉酚添加濃度的提高導(dǎo)致瘤胃揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量下降 （P＜0.05）， 但 0.025 mg/kg添加組與0.05 mg/kg添加組間差異不顯著（P＞0.05）；隨著棉酚添加濃度的提高，乙酸、丙酸產(chǎn)量也呈下降趨勢(shì)，未添加組與添加組間差異顯著（P＜0.05）；棉酚添加組較未添加組乙酸與丙酸比顯著增加（P ＜ 0.05），但添加組之間差異不顯著（P ＞ 0.05）。

表3 棉酚對(duì)瘤胃揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量的影響

2.4 棉酚對(duì)體外瘤胃發(fā)酵微生物蛋白合成的影響 由表4可見，0.025 mg/kg添加水平對(duì)微生物合成蛋白效率無(wú)顯著影響（P＞0.05），但隨著添加濃度的提高，瘤胃微生物蛋白合成效率顯著降低（P＜0.05），但在0.05 mg/kg添加組與0.25 mg/kg添加組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

反芻動(dòng)物對(duì)棉酚的脫毒，主要是棉酚結(jié)合到可溶性蛋白質(zhì)上的賴氨酸自由氨基（ε-）位點(diǎn)上，即游離棉酚變成結(jié)合棉酚，從而使胃腸道不能對(duì)其消化吸收（Calhoun等，1995）。研究證實(shí)，離心的瘤胃液中賴氨酸與游離棉酚是結(jié)合在一起的（Raymond 與 Hwei，1962），由于與棉酚的結(jié)合，使日糧難以消化吸收賴氨酸（Randel等，1996）。本研究結(jié)果表明，棉酚添加濃度的提高抑制了干物質(zhì)的降解。孫云章等（2007）試驗(yàn)結(jié)果表明，20 mg/L和40 mg/L棉酚處理組瘤胃真菌發(fā)酵具有明顯的滯后效應(yīng)，且這種滯后效應(yīng)隨棉酚濃度的增加而愈明顯，提示棉酚對(duì)真菌發(fā)酵具有一定的抑制作用，也證實(shí)了棉酚的存在會(huì)抑制瘤胃發(fā)酵。

表4 棉酚對(duì)體外瘤胃發(fā)酵微生物蛋白合成的影響

除與氨基酸結(jié)合影響到干物質(zhì)降解率之外，棉酚與礦物質(zhì)也具有較高的親和力，鐵與棉酚能夠結(jié)合（Cheeke，1998；Kerr，1989）。 研究表明日糧添加 FeSO4（FeSO4∶棉籽粕，2∶1），使鐵離子與棉酚形成了無(wú)毒性的物質(zhì)，降低了棉酚的副作用（Clawson和 Smith，1966）。 游離棉酚也可以與鋅結(jié)合成結(jié)合棉酚，結(jié)合棉酚在消化道中不易被消化 （Calhoun等，1995、1991）。 通過(guò)以上研究結(jié)果可以看出反芻動(dòng)物日糧棉酚的攝入會(huì)對(duì)瘤胃內(nèi)鐵、鋅濃度及利用造成影響，因?yàn)楹芏嗝傅妮o酶需要鐵、鋅的參與，這也許是影響到干物質(zhì)降解的另一可能性因素。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)體外產(chǎn)氣法研究了不同棉酚添加濃度對(duì)苜蓿瘤胃發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，棉酚的添加會(huì)降低苜蓿體外瘤胃降解，同時(shí)減少了微生物蛋白合成量。

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