FQ—PCR法痰結核桿菌DNA檢測及其臨床應用

宋予娟

【摘要】 目的 探討熒光定量聚合酶鏈式反應 （FQ-PCR）法痰結核桿菌DNA檢測及其臨床應用。方法 分別以FQ-PCR， 集菌培養(yǎng)和染色鏡檢檢測入選患者的痰標本， 比較各方法在結核病診斷中的作用。結果 三種檢測方法的敏感性為71.8%， 39.0%， 26.5%， 顯示FQ-PCR法敏感度最高。結論 FQ-PCR法具有簡便、快捷、敏感、特異性高的特點， 可以快速及時準確的為臨床提供診斷依據(jù)。

【關鍵詞】 痰；結核桿菌；熒光定量聚合酶鏈反應

結核病是嚴重危害人類健康的傳染病， 曾一度得到控制， 但目前其仍是全球性的重大公共衛(wèi)生問題之一。結核分枝桿菌的實驗室檢測是結核病診斷和治療轉歸的重要依據(jù)。傳統(tǒng)結核桿菌檢測痰涂片抗酸染色鏡檢陽性率低， 集菌培養(yǎng)周期太長而熒光定量FQ-PCR是近年發(fā)展起來的一種重要的基因診斷技術[1]， 顯示出了其靈敏度高， 特異性強， 快速簡便等特點， 得到了廣泛的應用[2]。本研究采用Taqman熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測痰標本結核桿菌DNA， 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年4月～2012年1月到本院診斷與治療患者的痰液標本112份， 其中男74份， 女38份， 年齡17～65歲。病例入選根據(jù)臨床癥狀體征及胸部X線表現(xiàn)臨床診斷為結核病患者64例（肺結核組）， 非結核病患者48例（非結核組）。

1. 2 痰標本收集 使用帶蓋無菌樣本盒， 交由患者自行留取痰標本。要求患者晨起后漱口， 深咳出1～2口痰入樣本盒， 加蓋送檢。

1. 3 試劑和儀器 4%NaOH， FQ-PCR試劑盒由深圳凱杰生物工程有限公司提供， 儀器由上海宏石生產(chǎn)的熒光定量分析儀分析。

1. 4 抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法 操作參考《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[3]進行。

1. 5 痰液DNA的提取 按試劑盒說明書取0.9 ml痰標本加入2倍樣本體積40%NaOH液化后13000 r/min離心10 min去上清液向沉淀中加入1 ml滅菌水， 充分震蕩混勻， 13000 r/min離心10 min去上清液重復洗滌3次。沉淀中加入30 μl DNA提取液充分震蕩混勻100℃水域10 min待冷卻至室溫13000 r/min離心10 min去上清液備用。

1. 6 FQ-RCR法 按試劑操作說明書對上述DNA模版加入PCR反應管， 按規(guī)定循環(huán)參數(shù)進行PCR反應。利用陽性梯度標準品的CT值（循環(huán)閾值）所制作的標準曲線制定出樣品的DNA拷貝數(shù)。

2 結果

64例結核病例， 48例非結核病患者痰標本染色鏡檢， 集菌培養(yǎng)， FQ-PCR， 其陽性率分別為26.5%， 39.0%， 71.8%。而48例非結核組FQ-PCR檢測為0， 符合率100.0%。結果見表1。

3 討論

結核桿菌有人型、牛型、鳥型、鼠型和冷血動物型等， 對人類主要是人型， 結核桿菌主要感染途徑為呼吸道， 也可以通過破損黏膜和消化道等多種途徑進入人體， 侵犯各部位組織， 引起相應的結核病， 以肺結核多見， 此結核為乙類傳染病， 危害大， 肺結核早診斷并進行正規(guī)治療對預后治療有明顯的影響。病原學檢查確認結核桿菌感染是肺結核診斷的“金標準”。

由此可見， 直接涂片法雖具有簡便、快捷、價廉等特點， 但無法辨別出死菌和活菌且受實驗室條件、人員環(huán)境、技術水品的影響較大， 靈敏度低， 特異性差， 各種抗酸桿菌均可著色， 有些耐藥菌對抗酸染色不敏感， 難以查到出現(xiàn)假陽性結果。集菌培養(yǎng)法， 時間長且靈敏度低， 特異性差， 檢驗結果滯后[1]。而FQ-PCR法簡便快捷靈敏度高， 重復性好并且極大地縮短了檢測時間， 適合應用于結核病的臨床快速診斷。FQ-PCR方法檢測的是病原體核酸， 不管結核桿菌是否為活的細菌， FQ-PCR均能檢出， 因此， 在經(jīng)抗生素治療1個療程后， 必須兩周后才能做FQ-PCR檢測， 以避免臨床假陽性。但目前試劑性能和結果檢測的方法各異， 在結核桿菌感染的診斷上， 抗酸染色和FQ-PCR同時陽性即可確診。如FQ-PCR陽性， 抗酸染色陰性， 應重復檢測標本， 直到FQ-PCR或抗酸染色陽性才可確診；如抗酸染色陽性， FQ-PCR法陰性， 應重復檢測， 并排除非結核分歧桿菌感染的可能。并且FQ-PCR法檢測結核分枝桿菌變化情況， 觀察抗結核藥物的治療進展為臨床醫(yī)生及時掌握患者的病情和開展后續(xù)督導治療提供了動態(tài)數(shù)據(jù)， 在實踐中起到了積極作用， 效果明顯， 有重要的臨床意義。

參考文獻

[1] 鄔艷. 熒光定量PCR檢測痰結核桿菌特異性DNA序列及其臨床應用. 中外醫(yī)學研究， 2012， 10（16）：65-67.

[2] 謝漢彬， 鄭崇輝， 黃國盛 . 實時熒光定量PCR法在檢測血漿結核桿菌DNA的應用. 河北醫(yī)學， 2012， 18（5）：698-699.

[3] 金建東. 熒光定量PCR檢測痰結核桿菌DNA及其臨床應用. 齊齊哈爾醫(yī)學院學報， 2010， 31（22）：3565.

[收稿日期：2014-08-27]

【摘要】 目的 探討熒光定量聚合酶鏈式反應 （FQ-PCR）法痰結核桿菌DNA檢測及其臨床應用。方法 分別以FQ-PCR， 集菌培養(yǎng)和染色鏡檢檢測入選患者的痰標本， 比較各方法在結核病診斷中的作用。結果 三種檢測方法的敏感性為71.8%， 39.0%， 26.5%， 顯示FQ-PCR法敏感度最高。結論 FQ-PCR法具有簡便、快捷、敏感、特異性高的特點， 可以快速及時準確的為臨床提供診斷依據(jù)。

【關鍵詞】 痰；結核桿菌；熒光定量聚合酶鏈反應

結核病是嚴重危害人類健康的傳染病， 曾一度得到控制， 但目前其仍是全球性的重大公共衛(wèi)生問題之一。結核分枝桿菌的實驗室檢測是結核病診斷和治療轉歸的重要依據(jù)。傳統(tǒng)結核桿菌檢測痰涂片抗酸染色鏡檢陽性率低， 集菌培養(yǎng)周期太長而熒光定量FQ-PCR是近年發(fā)展起來的一種重要的基因診斷技術[1]， 顯示出了其靈敏度高， 特異性強， 快速簡便等特點， 得到了廣泛的應用[2]。本研究采用Taqman熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測痰標本結核桿菌DNA， 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年4月～2012年1月到本院診斷與治療患者的痰液標本112份， 其中男74份， 女38份， 年齡17～65歲。病例入選根據(jù)臨床癥狀體征及胸部X線表現(xiàn)臨床診斷為結核病患者64例（肺結核組）， 非結核病患者48例（非結核組）。

1. 2 痰標本收集 使用帶蓋無菌樣本盒， 交由患者自行留取痰標本。要求患者晨起后漱口， 深咳出1～2口痰入樣本盒， 加蓋送檢。

1. 3 試劑和儀器 4%NaOH， FQ-PCR試劑盒由深圳凱杰生物工程有限公司提供， 儀器由上海宏石生產(chǎn)的熒光定量分析儀分析。

1. 4 抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法 操作參考《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[3]進行。

1. 5 痰液DNA的提取 按試劑盒說明書取0.9 ml痰標本加入2倍樣本體積40%NaOH液化后13000 r/min離心10 min去上清液向沉淀中加入1 ml滅菌水， 充分震蕩混勻， 13000 r/min離心10 min去上清液重復洗滌3次。沉淀中加入30 μl DNA提取液充分震蕩混勻100℃水域10 min待冷卻至室溫13000 r/min離心10 min去上清液備用。

1. 6 FQ-RCR法 按試劑操作說明書對上述DNA模版加入PCR反應管， 按規(guī)定循環(huán)參數(shù)進行PCR反應。利用陽性梯度標準品的CT值（循環(huán)閾值）所制作的標準曲線制定出樣品的DNA拷貝數(shù)。

2 結果

64例結核病例， 48例非結核病患者痰標本染色鏡檢， 集菌培養(yǎng)， FQ-PCR， 其陽性率分別為26.5%， 39.0%， 71.8%。而48例非結核組FQ-PCR檢測為0， 符合率100.0%。結果見表1。

3 討論

結核桿菌有人型、牛型、鳥型、鼠型和冷血動物型等， 對人類主要是人型， 結核桿菌主要感染途徑為呼吸道， 也可以通過破損黏膜和消化道等多種途徑進入人體， 侵犯各部位組織， 引起相應的結核病， 以肺結核多見， 此結核為乙類傳染病， 危害大， 肺結核早診斷并進行正規(guī)治療對預后治療有明顯的影響。病原學檢查確認結核桿菌感染是肺結核診斷的“金標準”。

由此可見， 直接涂片法雖具有簡便、快捷、價廉等特點， 但無法辨別出死菌和活菌且受實驗室條件、人員環(huán)境、技術水品的影響較大， 靈敏度低， 特異性差， 各種抗酸桿菌均可著色， 有些耐藥菌對抗酸染色不敏感， 難以查到出現(xiàn)假陽性結果。集菌培養(yǎng)法， 時間長且靈敏度低， 特異性差， 檢驗結果滯后[1]。而FQ-PCR法簡便快捷靈敏度高， 重復性好并且極大地縮短了檢測時間， 適合應用于結核病的臨床快速診斷。FQ-PCR方法檢測的是病原體核酸， 不管結核桿菌是否為活的細菌， FQ-PCR均能檢出， 因此， 在經(jīng)抗生素治療1個療程后， 必須兩周后才能做FQ-PCR檢測， 以避免臨床假陽性。但目前試劑性能和結果檢測的方法各異， 在結核桿菌感染的診斷上， 抗酸染色和FQ-PCR同時陽性即可確診。如FQ-PCR陽性， 抗酸染色陰性， 應重復檢測標本， 直到FQ-PCR或抗酸染色陽性才可確診；如抗酸染色陽性， FQ-PCR法陰性， 應重復檢測， 并排除非結核分歧桿菌感染的可能。并且FQ-PCR法檢測結核分枝桿菌變化情況， 觀察抗結核藥物的治療進展為臨床醫(yī)生及時掌握患者的病情和開展后續(xù)督導治療提供了動態(tài)數(shù)據(jù)， 在實踐中起到了積極作用， 效果明顯， 有重要的臨床意義。

參考文獻

[1] 鄔艷. 熒光定量PCR檢測痰結核桿菌特異性DNA序列及其臨床應用. 中外醫(yī)學研究， 2012， 10（16）：65-67.

[2] 謝漢彬， 鄭崇輝， 黃國盛 . 實時熒光定量PCR法在檢測血漿結核桿菌DNA的應用. 河北醫(yī)學， 2012， 18（5）：698-699.

[3] 金建東. 熒光定量PCR檢測痰結核桿菌DNA及其臨床應用. 齊齊哈爾醫(yī)學院學報， 2010， 31（22）：3565.

[收稿日期：2014-08-27]

【摘要】 目的 探討熒光定量聚合酶鏈式反應 （FQ-PCR）法痰結核桿菌DNA檢測及其臨床應用。方法 分別以FQ-PCR， 集菌培養(yǎng)和染色鏡檢檢測入選患者的痰標本， 比較各方法在結核病診斷中的作用。結果 三種檢測方法的敏感性為71.8%， 39.0%， 26.5%， 顯示FQ-PCR法敏感度最高。結論 FQ-PCR法具有簡便、快捷、敏感、特異性高的特點， 可以快速及時準確的為臨床提供診斷依據(jù)。

【關鍵詞】 痰；結核桿菌；熒光定量聚合酶鏈反應

結核病是嚴重危害人類健康的傳染病， 曾一度得到控制， 但目前其仍是全球性的重大公共衛(wèi)生問題之一。結核分枝桿菌的實驗室檢測是結核病診斷和治療轉歸的重要依據(jù)。傳統(tǒng)結核桿菌檢測痰涂片抗酸染色鏡檢陽性率低， 集菌培養(yǎng)周期太長而熒光定量FQ-PCR是近年發(fā)展起來的一種重要的基因診斷技術[1]， 顯示出了其靈敏度高， 特異性強， 快速簡便等特點， 得到了廣泛的應用[2]。本研究采用Taqman熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測痰標本結核桿菌DNA， 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年4月～2012年1月到本院診斷與治療患者的痰液標本112份， 其中男74份， 女38份， 年齡17～65歲。病例入選根據(jù)臨床癥狀體征及胸部X線表現(xiàn)臨床診斷為結核病患者64例（肺結核組）， 非結核病患者48例（非結核組）。

1. 2 痰標本收集 使用帶蓋無菌樣本盒， 交由患者自行留取痰標本。要求患者晨起后漱口， 深咳出1～2口痰入樣本盒， 加蓋送檢。

1. 3 試劑和儀器 4%NaOH， FQ-PCR試劑盒由深圳凱杰生物工程有限公司提供， 儀器由上海宏石生產(chǎn)的熒光定量分析儀分析。

1. 4 抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法 操作參考《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[3]進行。

1. 5 痰液DNA的提取 按試劑盒說明書取0.9 ml痰標本加入2倍樣本體積40%NaOH液化后13000 r/min離心10 min去上清液向沉淀中加入1 ml滅菌水， 充分震蕩混勻， 13000 r/min離心10 min去上清液重復洗滌3次。沉淀中加入30 μl DNA提取液充分震蕩混勻100℃水域10 min待冷卻至室溫13000 r/min離心10 min去上清液備用。

1. 6 FQ-RCR法 按試劑操作說明書對上述DNA模版加入PCR反應管， 按規(guī)定循環(huán)參數(shù)進行PCR反應。利用陽性梯度標準品的CT值（循環(huán)閾值）所制作的標準曲線制定出樣品的DNA拷貝數(shù)。

2 結果

64例結核病例， 48例非結核病患者痰標本染色鏡檢， 集菌培養(yǎng)， FQ-PCR， 其陽性率分別為26.5%， 39.0%， 71.8%。而48例非結核組FQ-PCR檢測為0， 符合率100.0%。結果見表1。

3 討論

結核桿菌有人型、牛型、鳥型、鼠型和冷血動物型等， 對人類主要是人型， 結核桿菌主要感染途徑為呼吸道， 也可以通過破損黏膜和消化道等多種途徑進入人體， 侵犯各部位組織， 引起相應的結核病， 以肺結核多見， 此結核為乙類傳染病， 危害大， 肺結核早診斷并進行正規(guī)治療對預后治療有明顯的影響。病原學檢查確認結核桿菌感染是肺結核診斷的“金標準”。

由此可見， 直接涂片法雖具有簡便、快捷、價廉等特點， 但無法辨別出死菌和活菌且受實驗室條件、人員環(huán)境、技術水品的影響較大， 靈敏度低， 特異性差， 各種抗酸桿菌均可著色， 有些耐藥菌對抗酸染色不敏感， 難以查到出現(xiàn)假陽性結果。集菌培養(yǎng)法， 時間長且靈敏度低， 特異性差， 檢驗結果滯后[1]。而FQ-PCR法簡便快捷靈敏度高， 重復性好并且極大地縮短了檢測時間， 適合應用于結核病的臨床快速診斷。FQ-PCR方法檢測的是病原體核酸， 不管結核桿菌是否為活的細菌， FQ-PCR均能檢出， 因此， 在經(jīng)抗生素治療1個療程后， 必須兩周后才能做FQ-PCR檢測， 以避免臨床假陽性。但目前試劑性能和結果檢測的方法各異， 在結核桿菌感染的診斷上， 抗酸染色和FQ-PCR同時陽性即可確診。如FQ-PCR陽性， 抗酸染色陰性， 應重復檢測標本， 直到FQ-PCR或抗酸染色陽性才可確診；如抗酸染色陽性， FQ-PCR法陰性， 應重復檢測， 并排除非結核分歧桿菌感染的可能。并且FQ-PCR法檢測結核分枝桿菌變化情況， 觀察抗結核藥物的治療進展為臨床醫(yī)生及時掌握患者的病情和開展后續(xù)督導治療提供了動態(tài)數(shù)據(jù)， 在實踐中起到了積極作用， 效果明顯， 有重要的臨床意義。

參考文獻

[1] 鄔艷. 熒光定量PCR檢測痰結核桿菌特異性DNA序列及其臨床應用. 中外醫(yī)學研究， 2012， 10（16）：65-67.

[2] 謝漢彬， 鄭崇輝， 黃國盛 . 實時熒光定量PCR法在檢測血漿結核桿菌DNA的應用. 河北醫(yī)學， 2012， 18（5）：698-699.

[3] 金建東. 熒光定量PCR檢測痰結核桿菌DNA及其臨床應用. 齊齊哈爾醫(yī)學院學報， 2010， 31（22）：3565.

[收稿日期：2014-08-27]