HPLC法同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸的含量*

黃祝剛，于亮，左琳，滿其倩，容蓉，鞏麗麗，蔣海強(qiáng)，呂青濤

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa willd)的干燥全草。近代研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫功能、抗衰老、抗氧化、保肝利膽、抗化學(xué)誘變等作用［1–3］，其中主要的化合物有蒽醌類、烷烴類、萜類、有機(jī)酸類、生物堿類、揮發(fā)油類、黃酮類、多糖類、甾醇類、氨基酸以及一些微量元素等［4–6］。筆者在對(duì)白花蛇舌草乙酸乙酯部位進(jìn)行抗子宮內(nèi)膜癌活性研究時(shí)，通過活性篩選分離得到了對(duì)香豆酸和熊果酸兩種成分。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，對(duì)香豆酸具有抗癌和抗心血管病的作用［7–8］；熊果酸具有多方面的藥理作用，它對(duì)體外革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌均有活性，還有抗?jié)儭㈡?zhèn)咳、抗癌作用，可以抗突變、抗氧化、抗血管瘤生成和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的分化［9］。為考察藥材中對(duì)香豆酸和熊果酸的含量及其與抗癌作用的關(guān)系，筆者首次建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸含量的方法，并對(duì)7批白花蛇舌草藥材中對(duì)香豆酸和熊果酸的含量進(jìn)行了測(cè)定及對(duì)比，也為白花蛇舌草藥材活性成分含量測(cè)定提供了參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1100型，附帶DAD檢測(cè)器、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī)，美國(guó)安捷倫公司；

電子天平：AE240型，瑞士梅特勒公司；

對(duì)香豆酸、熊果酸化學(xué)對(duì)照品：批號(hào)分別為D–032–140728，X–006–140801–2，經(jīng)HPLC檢測(cè)對(duì)香豆酸和熊果酸純度均在98%以上，北京寶賽希望生物科技有限公司；

白花蛇舌草藥材：濟(jì)南市漱玉平民大藥房、七星大藥房和康之源大藥房等(產(chǎn)地及批號(hào)分別為江西111201，130301，130612；安徽130906；廣西120908，130911；湖北120618)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定為茜草科草本植物白花蛇舌草；

甲醇：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市達(dá)森化工產(chǎn)品銷售有限公司；

實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Eclipse SB–C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.05%甲酸水溶液(A)–甲醇(B)，流 量 為1 mL／min；梯 度 洗 脫：0～20 min B為30%～45%，20～21 min B為45%～88%，21～45 min B為88%；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：310 nm(對(duì)香豆酸)，210 nm(熊果酸)；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

稱取對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成0.035 8 mg／mL的對(duì)香豆酸溶液；稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成0.426 mg／mL的熊果酸溶液。

1.4 樣品溶液的制備

稱取白花蛇舌草粉末(0.84～0.42 mm)約1 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇溶液80 mL，95℃水浴回流提取2.0 h，共提取3次，濾過，合并濾液，減壓干燥蒸干，以甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，制得樣品溶液。

1.5 色譜圖

在1.2色譜條件下對(duì)混合對(duì)照品溶液及樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑選擇

以對(duì)香豆酸與熊果酸的含量為指標(biāo)，進(jìn)行了白花蛇舌草的提取溶劑考察，比較了一系列不同濃度的乙醇提取物中二者的含量差異，最終選擇70%乙醇對(duì)二者同時(shí)提取較為適宜。

圖1 310 nm波長(zhǎng)下混合對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 310 nm波長(zhǎng)下樣品溶液色譜圖

圖3 210 nm波長(zhǎng)下混合對(duì)照品溶液色譜圖

圖4 210 nm波長(zhǎng)下樣品溶液色譜圖

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)考察

采用DAD檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，采集光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)香豆酸和熊果酸分別在310 nm處和210 nm處有最大吸收，故分別選擇310 nm和210 nm作為對(duì)香豆酸和熊果酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。當(dāng)采用DAD檢測(cè)器時(shí)，可以同時(shí)采集多個(gè)波長(zhǎng)下的色譜圖，因此可以一次完成兩個(gè)組分不同波長(zhǎng)下的同時(shí)檢測(cè)。當(dāng)采用普通紫外檢測(cè)器時(shí)，可以在工作站軟件中設(shè)置波長(zhǎng)時(shí)間表，在兩組分的出峰時(shí)間分別采用不同波長(zhǎng)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)組分不同波長(zhǎng)下的同時(shí)測(cè)定。

2.3 流動(dòng)相選擇

首先采用等度洗脫的方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)成分很難與干擾峰有效分離，而采用梯度洗脫的方式，可以對(duì)對(duì)香豆酸和熊果酸達(dá)到很好的分離，并且在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)出峰。但是采用梯度洗脫的方式時(shí)，條件控制不好會(huì)導(dǎo)致重現(xiàn)性差，解決辦法是延長(zhǎng)每次進(jìn)樣前的平衡時(shí)間，且每次采用相同的條件平衡色譜柱，這樣會(huì)達(dá)到很好的分離效果。實(shí)驗(yàn)過程中比較了乙腈–水、乙腈–0.05%甲酸、甲醇–水、甲醇–2%冰乙酸、甲醇–0.05%甲酸5種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇–0.05%甲酸溶液梯度洗脫時(shí)，對(duì)香豆酸和熊果酸二者分離度均在1.5以上，各指標(biāo)峰峰形良好，基線平穩(wěn)，分離度高。

2.4 線性方程

精密量取對(duì)香豆酸和熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5，1，2，4，6，8 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)香豆酸和熊果酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得對(duì)香豆酸線性回歸方程為y=20 530x–37.56(r=0.999 8)；熊果酸線性回歸方程為y=8 321x+12.81(r=0.999 6)。結(jié)果表明，對(duì)香豆酸在0.001 79～0.028 64 mg／mL、熊果酸在0.021 3～0.340 8 mg／mL時(shí)，對(duì)香豆酸和熊果酸的質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一份樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果見表1。由表1可知，對(duì)香豆酸和熊果酸測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.37%和0.32%，說明該方法精密度良好。

表1 白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸的精密度試驗(yàn)(n=6)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份樣品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣分析，對(duì)香豆酸和熊果酸峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%和1.1%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)白花蛇舌草(0.84～0.42 mm)約1 g，精密稱定6份，按1.4方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下測(cè)定，測(cè)得藥材中對(duì)香豆酸和熊果酸的平均含量分別為0.021%和0.307%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%和1.8%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量同一批號(hào)的白花蛇舌草粉末(0.84～0.42 mm)1 g，精密稱量6份，分別精密加入對(duì)香豆酸和熊果酸對(duì)照品溶液，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，結(jié)果見表2。由表2可知，對(duì)香豆酸和熊果酸的平均回收率分別為98.59%和98.23%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.81%和0.94%，表明方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 對(duì)香豆酸和熊果酸的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測(cè)定

取7批白花蛇舌草粉末各3份，每份1 g，精密稱定，按1.4方法制備樣品溶液，在1.2色譜條件下測(cè)定對(duì)香豆酸和熊果酸的色譜峰面積，計(jì)算樣品中二者的含量，結(jié)果見表3。由表3可知，不同產(chǎn)地及批號(hào)的白花蛇舌草中二者的差異較大，其中江西產(chǎn)地的白花蛇舌草二者含量均最高，而廣西產(chǎn)地的藥材二者含量均最少。

表3 白花蛇舌草藥材中對(duì)香豆酸和熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果(n =3)

3 結(jié)語

建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸兩種化合物含量的方法，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度，為白花蛇舌草藥材活性成分含量測(cè)定奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)果表明不同產(chǎn)地及批號(hào)的白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸含量的差異較大，其中江西產(chǎn)白花蛇舌草中的對(duì)香豆酸及熊果酸含量均較高，所以對(duì)白花蛇舌草乙酸乙酯部位進(jìn)行抗子宮內(nèi)膜癌活性研究時(shí)，宜采用江西產(chǎn)的藥材。

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