轉(zhuǎn)植酸酶基因（PhyA2）玉米對家蠶腸道微生物多樣性的影響

郭穎慧+孫紅煒+李凡+楊淑珂+楊正友+路興波

摘 要：以轉(zhuǎn)植酸酶玉米10TPY005、非轉(zhuǎn)植酸酶親本玉米蠡玉35的花粉分別飼喂家蠶3個齡期，取3齡末期家蠶利用Biolog-Eco法分別從其腸道微生物群落多樣性的平均顏色變化率（AWCD值）、四種碳源利用率、群落代謝功能多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson和McIntosh指數(shù)）及主成分分析四個方面進行指標測定，從而研究轉(zhuǎn)植酸酶玉米對家蠶腸道環(huán)境菌群多樣性的影響。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉喂食的家蠶與親本玉米花粉喂食和空白對照兩組家蠶相比，上述各指標總體無顯著性差異，即轉(zhuǎn)植酸酶玉米對家蠶腸道微生物多樣性未造成明顯影響。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)植酸酶玉米；家蠶；腸道微生物多樣性

中圖分類號：S513+Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0119-05

玉米含磷豐富，但65%以上的磷以植酸磷形式存在。由于豬及禽類等單胃動物缺乏分解植酸的內(nèi)源性酶系統(tǒng)，所以植酸磷對于這些動物沒有營養(yǎng)價值，還可能造成有效磷利用率低以及環(huán)境污染等問題。只有植酸酶才能把磷從植酸與磷復(fù)合物中釋放出來被動物吸收利用[1]。轉(zhuǎn)植酸酶玉米是通過基因工程技術(shù)，將微生物中能夠高效表達植酸酶的基因通過加工修改后導(dǎo)入到玉米基因組中，讓其成為能夠表達植酸酶的玉米新品種。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米10TPY005由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所培育完成，用作動物飼料無需添加外源植酸酶，已經(jīng)獲生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，商品化前景較好。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用， 推動了世界轉(zhuǎn)基因作物技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化的迅速發(fā)展[2]。雖然轉(zhuǎn)基因作物有很多優(yōu)點，但轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題，一直是人們關(guān)注的焦點[3]。目前，已有轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米生育期及秸稈還田期對根際微生物數(shù)量和細菌菌群多樣性的影響[4]及轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉對亞洲玉米螟和棉鈴蟲生長發(fā)育影響的研究[5]，對田間昆蟲種群的影響也有報道[6]，然而關(guān)于轉(zhuǎn)植酸酶基因植物對某些昆蟲腸道微生物多樣性影響的研究還鮮有報道。家蠶為鱗翅目昆蟲的代表，喜食桑葉且具有寡食性，桑樹多依靠玉米大田生長，轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉經(jīng)風(fēng)吹落于桑葉易被家蠶食用。因此研究轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉對家蠶腸道微生物多樣性的影響，有助于從昆蟲腸道群落角度科學(xué)評價轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的生態(tài)風(fēng)險，可以為轉(zhuǎn)植酸酶基因作物的合理種植提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米10TPY005（奧瑞金公司提供），蠡玉35（10TPY005親本對照），家蠶品種皓月（山東省蠶業(yè)研究所科研用蠶）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗地位于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)場工作站，兩個玉米品種各設(shè)立3個重復(fù)小區(qū)。每小區(qū)長100 m，寬3 m，株距20 cm，行距60 cm。試驗田四周300 m為菜田及建筑物，無玉米種植。玉米生育過程中不施肥不噴灑農(nóng)藥。

在玉米雄蕊抽出、尚未散粉前，用授粉袋將玉米雄蕊套住，每小區(qū)套10株玉米。在玉米散粉盛期，分別將轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米取回到實驗室。采集花粉用200目分樣篩過篩，除去花藥等雜質(zhì)，放入50 mL離心管中，迅速用液氮冷凍后放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米花粉按每毫升蒸餾水0、1、5、10 mg的花粉量分別制成不同花粉濃度的懸浮液，將新鮮桑葉分別放入不同濃度的花粉懸浮液中，并充分搖動，使花粉均勻分布在葉片上，然后取出晾干。

取直徑20 cm的培養(yǎng)皿，底部鋪一濕潤的濾紙，放入沾有玉米花粉的新鮮桑樹葉片，然后接入20頭家蠶，每2 d更換一次新鮮葉片，在25℃、光照周期12L∶ 12D條件下進行飼喂，到3齡眠蠶結(jié)束，每處理重復(fù)5次。

試驗用家蠶分別進行如下標記：空白CK：不加玉米花粉；A1：加1 mg/mL轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉；A5：加5 mg/mL轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉；A10：加10 mg/mL轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉； 351：加1 mg/mL蠡玉35玉米花粉； 355：加5 mg/mL蠡玉35玉米花粉； 3510：加10 mg/mL蠡玉35玉米花粉。

1.3 測定方法

取3齡末期家蠶用75%乙醇體表消毒3 min，再用0.8%生理鹽水清洗。無菌狀態(tài)下解剖取出家蠶腸道，用 0.8%生理鹽水清洗后收集至2.0 mL離心管，加 0.8%生理鹽水200 μL，研磨勻漿后定容至15 mL。

將研磨好的樣品加到Biolog-Eco微平板中，每孔150 μL，每樣一板，每處理重復(fù)3次。將Biolog-Eco微平板置于恒溫培養(yǎng)箱（30℃）中培養(yǎng)168 h，每隔24 h用Biolog讀數(shù)儀讀數(shù)1次[7]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

微生物整體活性指標采用微平板每孔平均顏色變化率（AWCD）表示，計算公式為：

AWCD=∑（A-ACK）31

式中：A為每個碳源孔590 nm下的吸光度值減去750 nm下的吸光度值；ACK為對照孔的吸光度值。

利用各樣品培養(yǎng)的數(shù)據(jù)，計算其微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)（H′）、Simpson指數(shù)（D）和McIntosh指數(shù)（U）。

式中：Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率；ni是第i孔的相對吸光值[8]。

采用統(tǒng)計軟件DPS進行方差分析和主成分分析，多重比較采用Duncan s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶腸道微生物群落平均顏色變化率的動態(tài)變化

平均顏色變化率（AWCD）是反映微生物群落整體活性的一個重要指標。微生物種類和數(shù)量越多，微孔板中能夠被利用的碳源種類和數(shù)量也就越多。由圖1可知，家蠶腸道微生物群落代謝的AWCD值隨時間變化的曲線具有一般微生物利用碳源底物的規(guī)律性（隨著培養(yǎng)時間的延長，微生物利用的碳源量均呈逐漸增多的趨勢，24～72 h增長迅速，此后逐漸趨于平穩(wěn)并達到12左右），即對環(huán)境存在比較明顯的適應(yīng)期、對數(shù)期和穩(wěn)定期等階段。喂食轉(zhuǎn)植酸玉米花粉及親本玉米花粉的家蠶腸道微生物群落平均顏色變化率（AWCD）無顯著性差異。endprint

2.2 家蠶腸道微生物群落對四類碳源的利用率

根據(jù)Bidog-Eco微平板中的碳源種類，可以將其歸類為糖類及其衍生物、氨基酸及其衍生物、脂肪酸和脂類及代謝中產(chǎn)物和次生代謝物四大類[9]。

采用96 h光密度值分析不同濃度不同基因型玉米花粉喂食的家蠶腸道微生物對四種類型碳源的利用程度。從圖2可以看出，家蠶腸道微生物對碳源的利用主要集中在糖類及其衍生物類碳源與脂類及脂肪酸類碳源上，對氨基酸及衍生物類碳源的利用率居中，對中間代謝產(chǎn)物及其次生代謝產(chǎn)物的利用程度最低。食用轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉、蠡玉35玉米花粉和空白對照的家蠶腸道微生物對每類碳源的利用率無顯著性差異。

2.3 家蠶腸道微生物群落代謝功能多樣性指數(shù)分析

Shannon指數(shù)（H′）用以評估群落中物種的豐富度，轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉、蠡玉35玉米花粉喂食的家蠶腸道微生物群落Shannon多樣性指數(shù)差異不顯著（表1）。Simpson指數(shù)（D）較多地反映群落中常見的物種，是衡量群落功能多樣性的一個重要指標[10]。如表1所示，食用轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉與非轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉和空白對照的家蠶腸道微生物的Simpson指數(shù)無顯著性差異。McIntosh指數(shù)（U）是對微生物群落物種均一性的衡量[11]，由表1可知，轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉和非轉(zhuǎn)基因玉米花粉喂食的家蠶及空白對照的腸道微生物群落McIntosh均勻度指數(shù)同樣沒有顯著性差異?？梢?，轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉對家蠶腸道微生物群落的物種豐富度、最常見物種的優(yōu)勢度和均勻度無明顯影響。

2.4 家蠶腸道微生物群落代謝功能主成分分析

利用培養(yǎng)96 h測定的AWCD值，對轉(zhuǎn)基因和兩種對照組的家蠶腸道微生物群落利用Biolog 微平板中31種碳源（表3）的情況進行了主成分分析，得到的主元向量中6個主成分特征值的貢獻率與累積貢獻率如表2，可見6個主成分即可表征原變量的全部信息。

主成分分析將不同樣品的多元向量變換為互不相關(guān)的主分向量，在其空間中可用點的位置直觀反映出不同微生物群落的代謝特征。由圖3可知，喂食不同濃度不同基因型花粉的家蠶腸道微生物群落的碳源利用模式相似，加1 mg/mL轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉和蠡玉35玉米花粉喂食的家蠶均分布在x軸負方向，加5 mg/mL轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉和蠡玉35玉米花粉喂食的家蠶也均分布在x軸負方向，加10 mg/mL轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉和蠡玉35玉米花粉喂食的家蠶均分布在x軸正方向，說明x軸沒有對不同基因型玉米花粉喂食的家蠶腸道微生物碳源利用模式造成主要分異，不同基因型碳源利用模式相同。

第1主成分、第2主成分、第3主成分和第4主成分累積貢獻率達到85.776%，因此，可以說微生物群落對31種單一碳源的利用有85.776%是與PC1、PC2、PC3和PC4呈正相關(guān)的（表3）。α-D-乳糖、吐溫 80、D-甘露醇、α-環(huán)式糊精、N-乙酰-D葡萄糖氨等與第一軸的關(guān)系最大，說明糖類碳源在PC1軸上權(quán)重較大。2-羥基苯甲酸、β-甲基-D-葡萄糖苷、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、1-磷酸葡萄糖等與第二軸的關(guān)系最大，說明中間及次生代謝產(chǎn)物類碳源和糖類碳源在PC2軸上權(quán)重較大。丙酮酸甲酯、L-蘇氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸等與第三軸的關(guān)系最大，說明脂肪酸及脂類和氨基酸衍生物在PC3軸上權(quán)重較大。1-磷酸葡萄糖、α-丁酮酸、D-蘋果酸等與第四軸的關(guān)系最大，說明中間及次生代謝產(chǎn)物類碳源在PC4軸上權(quán)重較大。

3 結(jié)論與討論

昆蟲腸道微生物與其消化、營養(yǎng)以及發(fā)育密切相關(guān)[12]。腸道微生物群落的豐富度和群落結(jié)構(gòu)功能的多樣性是衡量昆蟲腸道是否健康的一個重要指標。因此，評價轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉對家蠶腸道微生物的影響，可在一定程度探明其對家蠶生物學(xué)的影響。

Biolog-Eco微平板共有31種碳源，每孔平均顏色變化率（AWCD）能夠反映微生物群落的整體碳源代謝活性。從理論上講，微生物個體數(shù)量多且種群豐富，AWCD值可達到最大值；若微生物個體數(shù)量少而種群豐富，則開始時AWCD值較小，但隨著時間的延長AWCD值逐漸增加[13]。本試驗結(jié)果表明，家蠶的腸道微生物AWCD值在96 h之前均隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)迅速增大的趨勢，此后逐漸趨于平穩(wěn)，并且食用不同濃度不同基因型玉米花粉的家蠶腸道微生物之間無顯著性差異，說明家蠶腸道微生物均能利用相關(guān)碳源且種群豐富、個體數(shù)量多、代謝活性較強。

采用96 h光密度值分析不同濃度不同基因型玉米花粉喂食的家蠶腸道微生物對糖類及其衍生物類碳源、脂類及脂肪酸類碳源、氨基酸及其衍生物類碳源和中間代謝產(chǎn)物及其次生代謝產(chǎn)物碳源類型的利用程度，轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉喂食的家蠶腸道微生物對碳源的利用率與食用蠡玉35玉米花粉和空白對照相比無顯著性差異。

從家蠶腸道微生物的Shannon、Simpson、McIntosh多樣性指數(shù)分析可知，轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉對家蠶腸道微生物群落的物種豐富度、最常見物種的優(yōu)勢度和均勻度無明顯影響。主成分分析表明，不同濃度、不同基因型的玉米花粉喂食的家蠶腸道微生物的碳源利用模式不存在顯著差異。

轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉被家蠶取食后可能發(fā)生以下幾種情況：（1）轉(zhuǎn)植酸酶在家蠶消化道內(nèi)未被溶解，而直接排出體外；（2）轉(zhuǎn)植酸酶被溶解，但在消化道內(nèi)有少量被消化吸收，大部分被排出體外；（3）轉(zhuǎn)植酸酶被家蠶吸收，但通過自身解毒酶的作用，將其降解[14]。 上述結(jié)果均未顯示出顯著性差異，即轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉對家蠶腸道微生物不具有顯著影響，從這個程度上來說，轉(zhuǎn)植酸酶玉米對家蠶腸道微生物多樣性是安全的。但是本研究供試轉(zhuǎn)植酸酶玉米花粉中的PhyA2基因是否可能存在于家蠶的腸道細菌中還有待檢測。

參 考 文 獻：

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