鹽脅迫下MaAQP1 轉基因擬南芥幼苗的生長和生理響應

許 奕， 徐碧玉， 胡 偉， 王 安 邦， 林 妃， 黃 東 梅， 李 艷 霞，宋 順

(1.中國熱帶農業(yè)科學院?？趯嶒炚?，海南 海口570102;2.海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 海口570102;3.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所/農業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 ?？?71101)

香蕉是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要經濟作物之一，被聯(lián)合國糧農組織(FAO)定位為發(fā)展中國家僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物［1-4］。香蕉前期植株較小，根系淺生，易受鹽害等脅迫的影響，土壤鹽分過多使根際土壤溶液滲透勢降低，促使植物吸收水分困難，香蕉在營養(yǎng)生長階段遇上鹽害，會使香蕉營養(yǎng)器官生長發(fā)育不良，生長速度和生長量顯著下降，嚴重還可能造成死亡。因此，對香蕉抗逆品種的改良是十分重要而且緊迫的。

水通道蛋白質(Aquaporins，AQP)在植物中是定位于特定的細胞核膜區(qū)域的一類膜蛋白質，能夠運輸水和其他小分子如甘油、尿素以及一些離子，且其能使植物不斷保持水分，在植物中具有重要的作用［5］。近年來對AQP 的研究顯示了，植物能夠通過調節(jié)AQP 活性響應各種逆境的脅迫。在非生物脅迫中，主要包括旱害、冷害、鹽害、機械損傷、滲透脅迫、重金屬脅迫等。

前期試驗獲得了一個香蕉水通道蛋白質基因，命名為MaAQP1，對該基因進行了生物信息學分析［6-7］，并對香蕉植株進行一系列的非生物脅迫，表明該基因能響應高鹽脅迫。本試驗在此基礎上，構建了MaAQP1表達載體并將其轉入擬南芥中，測定高鹽脅迫下擬南芥幼苗的生長形態(tài)和生理指標，分析轉基因擬南芥的耐鹽能力，以期為利用該基因提高植物對高鹽脅迫的耐受性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥(Arabidopsis thalianaColumbia)，大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α 菌 株，根 癌 農 桿 菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101 菌株，植物表達載體pCAMBIA1304 質粒由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所保存。各種內切酶、T4 DNA 連接酶均購自TaKaRa 公司;TaqDNA 聚合酶和DNA Marker 購自北京全式金生物技術有限公司;卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)、利福平(Rif)及潮霉素(Hyg)等抗生素購自Sigma 公司;引物和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1MaAQP1植物表達載體的構建 將MaAQP1的全長編碼序列以質粒pMD18T-MaAQP1(前期已構建)為模板進行PCR 擴增。設計引物:正向引物5'-TTATCCATGG GGTCGTGCTTGCCTTTAC-3'(下劃線為NcoI 酶切位點)，反向引物5'-TCTCACTAGT CCTGCTCTTGAATGGGAT-3'(下劃線為SpeI 酶切位點)。將擴增產物純化后，經NcoI 和SpeI 雙酶切構建到具有強啟動子CaMV35S 的pCAMBIA1304 植物表達載體上。

1.2.2 轉基因擬南芥的獲得 將重組質粒pCAMBIA1304-MaAQP1轉化農桿菌GV3101 菌株，挑取陽性農桿菌轉化子，接種到含有利福平和卡那霉素的YEB 培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)。當菌液OD600=1.5 ～2.0 時，將培養(yǎng)液按1 ∶50 比例轉接培養(yǎng)，在OD600=1.8 ～2.0 時終止培養(yǎng)。離心收集菌體，用花序浸染液［5%蔗糖溶液，加入0.04%(體積比)吐溫-80］懸浮菌體，使OD600=0.6。利用花序浸泡法浸染擬南芥花序:選取開花前10 d 的健壯植株，使整個花序浸泡于浸染液中60 s，浸染后以較高的濕度暗箱培養(yǎng)24 h 后正常培養(yǎng)。隔3 d 處理1次，3 次后使其正常開花結果，收獲種子(記為T0代)，將種子撒播在選擇培養(yǎng)基(1/2MS，1.5% 蔗糖，0.7% 瓊脂，25 μg/ml 潮霉素B)上，放置在2 ～4 ℃的黑暗條件下春化處理1 ～3 d，后移至人工氣候箱中的培養(yǎng)房中培養(yǎng)，溫度控制在21 ～23 ℃，營養(yǎng)生長期每日光照時間為8 h，光照度為2 000 lx，相對濕度為70% ～90%，篩選至T3 代純合系。

1.2.3 轉基因植株的檢測

1.2.3.1 PCR檢測對獲得的T3代的純合MaAQP1轉基因植株進行PCR 檢測，以MaAQP1轉基因植株葉片總DNA 作為模板，設計引物:正向引物5'-GCATCACCTTCACCCTCT-3'，反向引物 5'-CCTTGTCCACCTGGCTAC-3'，擴增條件為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35 個循環(huán)。以野生型擬南芥基因組DNA為陰性對照模板，所構建的MaAQP1植物表達載體質粒DNA 為陽性對照模板。

1.2.3.2 Southern blot 檢測 選取PCR 檢測為陽性的植株，提取全基因組DNA，進行Southern blot 檢測，所設計探針為DNA 探針。探針引物:正向引物5'-ATGTGTAATCCCAGCAGC-3'，反 向 引 物 5'-CAAGGAGGACGGAAACAT-3'。

1.2.4 擬南芥幼苗鹽脅迫 將在1/2MS 培養(yǎng)基中生長4 d 的擬南芥幼苗移至分別添加了0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L NaCl 的1/2MS 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15 d，進行高鹽脅迫試驗。1.2.5 擬南芥中鈉離子( Na+) 、鉀離子( K+) 含量的測定 將擬南芥幼苗用超純水清洗干凈，置于燒杯中加入少量超純水煮10 min，將材料于80 ℃烘箱中48 h 烘干水分。取50 mg 干物質加入6 ml HNO3和21ml H2O2180 ℃處理15 min，用超純水補足至50 ml，用原子吸收光譜分析儀(Analyst 400，Perkin Elmer，USA)測定材料中Na+、K+含量。

1.2.6 擬南芥中電導率、丙二醛、脯氨酸含量、過氧化氫酶活性的測定 電導率的測定:將擬南芥幼苗放入加有10 ml 超純水的試管中，于25 ℃水浴鍋中孵育8 h，用電導率儀(DDBJ-350)測定初始電導率(C1)，將材料煮沸10 min，冷卻后測定電解液中的電導率(C2)。最終電導率的計算公式為C1/C2×100%。

丙二醛含量(MDA)的測定:稱取2 g 擬南芥幼苗，加入10%三氯乙酸(TCA)2 ml 及少量石英砂進行研磨，進一步加入8 ml TCA 充分研磨，將勻漿液以4 000 r/min 離心10 min，其上清液為MDA 提取液。取2 ml MDA 提取液(對照組取2 ml 蒸餾水)，加入2 ml 0.6% TBA 混勻，在試管上加棉塞，置沸水中加熱15 min，冷卻后以4 000 r/min 離心15 min，于波長532 nm 和450 nm 下測定OD值。MDA含量=6.45OD532-0.56OD450。

脯氨酸含量(PRO)的測定:取擬南芥幼苗材料0.5 g，置于大試管中，加入5 ml 3%磺基水楊酸溶液，管口加棉塞，于沸水浴中浸提10 min。取出試管冷卻至室溫后，吸取上清液2 ml，加2 ml 冰乙酸和3 ml 顯色液，于沸水浴中加熱40 min，由標準曲線求得提取液中脯氨酸濃度，樣品中脯氨酸含量=C·V/(W·a)×100(C為提取液中脯氨酸濃度，V為提取液總體積，a為測定時所吸取的體積，W為樣品質量)。

過氧化氫酶(CAT)活性的測定:稱取擬南芥幼苗0.5 g 置研缽中，加入2 ～3 ml 4 ℃下預冷的pH 7.0 磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成漿，轉入25 ml 容量瓶中，用緩沖液定容到刻度。置4 ℃冰箱中靜止10 min，取上清液于4 000 r/min 下離心15 min，上清液即為過氧化氫酶粗提液，4 ℃下保存?zhèn)溆?。?0 ml 試管3 支，其中2 支為樣品測定管，1支為空白管，分別加入0.2 ml 酶粗提液，1.5 ml pH7.8 磷酸，1 ml 蒸餾水。25 ℃預熱后，逐管加入0.3 ml 0.1 mol/L H2O2，每加完一管立即計時，并迅速倒入比色杯中，240 nm 下測定吸光度，每隔1 min讀數1 次，共測4 min，待3 支管全部測完后，計算酶活力。以1 min 內OD240減少0.1 的酶量為1 個酶活單位(μ)，過氧化氫酶活力［U/(g·min)，F(xiàn)W］=(ξOD240·VT)/(0.1·V1·t·FW)，ξOD240=ODSO-(ODS1+ODS2)/2，式中ODSO為對照管吸光值，ODS1、ODS2為樣品吸光值，VT為粗酶提取液總體積，V1 為測定用粗酶液體積，F(xiàn)W為樣品鮮質量，t為加過氧化氫到最后一次讀數時間。

1.2.7 鹽脅迫下擬南芥幼苗根部生長狀態(tài)的測定

將分別添加0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L NaCl 的1/2MS 培養(yǎng)基中生長15 d 的擬南芥幼苗進行根長及根毛統(tǒng)計。每個處理濃度取20 個樣品。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體的構建

用NcoI 和SpeI 對PCR 純化產物和pCAMBIA1304 質粒雙酶切，經T4 DNA 連接酶構建得到pCAMBIA1304-MaAQP1植物表達載體質粒，經PCR鑒定和雙酶切鑒定，得到預期大小的目的片段，后經測序序列正確，說明目的基因MaAQP1成功構建到載體pCAMBIA1304 上。

2.2 轉基因擬南芥的獲得和鑒定

利用浸泡法將pCAMBIA1304-MaAQP1導入野生型擬南芥中，T3 代獲得29 株純系后進行PCR 鑒定。以所獲得的株純系MaAQP1轉基因植株基因組DNA 為模板，圖1A 所示為其中一部分株系的PCR檢測結果。經Southern blot 檢測選取2 株獨立表達的株系進行后續(xù)試驗，分別命名為35S ∶ ∶MaAQP6和35S ∶ ∶MaAQP8(簡稱L6 和L8)，其中L6 為雙拷貝插入，L8 為單拷貝插入(圖1B)。

圖1 T3 代轉基因擬南芥的PCR 檢測(A)及Southern blot 檢測(B)Fig.1 PCR identification(A)and Southern blot(B)of T3 transgenic Arabidopsis thaliana plants

2.3 鹽脅迫對轉基因擬南芥生理指標的影響

圖2 野生型和轉基因株系中的K+、Na+含量Fig.2 K+ and Na+ contents in wild-type plants and MaAQP1-overexpressed transgenic lines

2.3.1 鹽脅迫對轉基因擬南芥中鉀離子( K+)、鈉離子(Na+)含量的影響 在高鹽條件下，植物細胞中具有較高的K+/Na+比［8］。為了檢測轉基因株系的耐鹽性，我們測定了正常條件以及150 mmol/L 鹽脅迫條件下野生型和轉基因株系中K+和Na+的濃度。在未進行鹽脅迫(對照)下，轉基因株系的K+濃度低于野生型株型，而Na+濃度在轉基因和野生型株系中并無明顯差異。經過鹽脅迫后，野生型和轉基因株系中的K+濃度均低于對照，而Na+濃度升高，其中轉基因株系的K+和Na+濃度均明顯低于野生型株系，同時，轉基因株系具有較高的K+/Na+比(圖2)。

2.3.2 鹽脅迫對轉基因擬南芥中電導率、丙二醛含量、脯氨酸含量及過氧化氫酶活性的影響 在正常條件下，野生型與轉基因株系的電導率、丙二醛含量、脯氨酸含量以及過氧化氫酶活性差異均不顯著。隨著鹽脅迫濃度的增加，野生型和轉基因株系4 種指標均逐漸升高，當鹽濃度為150 mmol/L 時，4 種指標均達到高峰(圖3)，其中，轉基因植株L6、L8 中電導率含量分別比野生型擬南芥高10%、5%，轉基因植株L6、L8 丙二醛含量分別比野生型擬南芥的低6%、19%，轉基因植株L6、L8 過氧化氫酶活性分別比野生型擬南芥高10%、8%，轉基因植株L6、L8中脯氨酸含量分別比野生型擬南芥高11%、4%。

圖3 鹽脅迫對轉基因和野生型擬南芥株系中電導率、丙二醛、脯氨酸含量和過氧化氫酶活性的影響Fig.3 Effects of salt stress on ion leakage，malondialdelyde content，proline content and CAT activity of wild-type and MaAQP1-overexpressed transgenic plants

2.4 鹽脅迫對轉基因擬南芥形態(tài)的影響

為了測試MaAQP1轉基因植株是否具有耐鹽能力，我們選取了幼苗階段進行高鹽脅迫試驗。將在1/2MS 培養(yǎng)基中生長4 d 的野生型以及轉基因株系的幼苗轉接至含不同NaCl 濃度的1/2MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)。當生長15 d，培養(yǎng)基中NaCl 的濃度為50 mmol/L 和100 mmol/L 時，野生型擬南芥及轉基因植株L6 和L8 的生長均未受到顯著影響。當NaCl濃度達到150 mmol/L 時，各株系開始表現(xiàn)出不同的生長狀況，野生型擬南芥和轉基因植株L6、L8 的根系均變短且子葉變小，L6 和L8 均有4 片子葉，而野生型僅有2 片子葉(圖4)。

圖4 鹽脅迫下擬南芥幼苗根系的生長Fig.4 Growth of A.thaliana roots under salt stress

經過各濃度的鹽脅迫處理，隨著鹽濃度的增加，野生型植株和轉基因植株的根長均逐漸變短，轉基因株系的根長均長于野生型株系，當鹽濃度達到150 mmol/L 時，野生型株系的主根明顯變短。在體視顯微鏡下觀察高鹽脅迫下野生型和轉基因株系根毛的發(fā)育情況，隨著鹽濃度的增加，野生型和轉基因株系的根毛數目均減少，但轉基因株系的根毛數目均比野生型的多，在150 mmol/L 鹽脅迫下，野生型株系平均1 cm 主根中根毛數目僅有30 左右，而轉基因株系仍有70 (5)。

圖5 鹽脅迫下擬南芥主根根長和根毛Fig.5 Taproot length and root hair of A.thaliana under salt stress

3 討論

水通道蛋白質(AQP)是一類位于各種細胞膜上24×103～34×103的小分子跨膜蛋白質［9］，能夠調節(jié)水分以及其他小分子物質運輸，如甘油、二氧化碳、氨氣、尿素、硼和過氧化氫等［5，10-11］，在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用。在不同的植物中已經發(fā)現(xiàn)了許多水通道蛋白質，其中擬南芥中有35個［12］，大米中有33 個［13］，玉米中有36 個［14］。根據序列同源性，AQP 被分成4 類，包括液泡膜內在蛋白質(TIPs)、質膜內在蛋白質(PIPs)、NOD26-like內在蛋白質(NIPs)和小的內在蛋白質(SIP)［9］。本研究中的MaAQP1屬于質膜內在蛋白質。

目前對AQP 的研究主要集中在AQP 與植物激素(ABA、乙烯)［15-17］、種子萌發(fā)、果實成熟和植物抗逆性［16］等方面。關于AQP 對植物抵御外界非生物脅迫的研究近年來成為研究其功能的一個熱點，許多試驗結果表明，植物能夠通過調節(jié)AQP 的活性響應各種逆境的脅迫。這種脅迫主要是非生物脅迫，包括旱害、冷害、鹽害、機械損傷、滲透脅迫、重金屬脅迫等。在植物中過量表達一些AQP 能夠提高轉基因植物對高鹽脅迫的耐受性［11，18-20］。過量表達TaAQP8能使鹽脅迫下轉基因植株的根系伸長［19］。在煙草中轉入NtAQP1，能夠提高高鹽脅迫下植物的水分利用率、導水率及產量［11］。

在本研究中，鹽脅迫下，與野生型植株相比，轉基因株系具有較高的K+/Na+比，并且轉基因株系中的電導率、脯氨酸含量及過氧化氫酶活性均比野生型的高，而丙二醛含量比野生型的低;轉基因株系主根受抑制程度較小，其根毛要遠多于野生型的。MaAQP1在擬南芥中的異源表達增強了轉基因擬南芥對高鹽脅迫的耐受性。此結果與該基因在香蕉中的表達特性相互印證。

［1］ 陳 波，張錫炎，黃 霄，等.香蕉枯萎病區(qū)土壤真菌多樣性分析［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41(11):354-357.

［2］ 唐 輝，肖 玫.香蕉水果饅頭的最佳配方和工藝條件研究［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41(8):293-294.

［3］ 黃 臂，周登博，張錫炎，等.1 株香蕉枯萎病菌拮抗菌鑒定及抑菌效果［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41(7):90-93.

［4］ 覃勇榮，覃海健，余美君，等.利用香蕉皮制作天然食品保鮮劑的可行性研究［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41(6):219-221.

［5］ KJELBOM P，LARSSON C，JOHANSSON I，et al.Aquaporins and water homeostasis in plants［J］.Trends Plant Sci，1999，4 (8):308-314.

［6］ 謝學立，劉菊華，徐碧玉，等.香蕉水通道蛋白基因在成熟果實中的表達分析與亞細胞定位研究［J］.安徽農業(yè)科學，2008，36 (29):12596-12599.

［7］ ZIEN CA，WANG C，WANG X，et al.In vivosubstrates and the contribution of the common phospholipase D，PLDa，towound-induced metabolism of lipids in Arabidopsis［J］.Biochim Biophys Acta ，2001，1530:236-248.

［8］ RUIZ-LOZANO J M，PORCEL R，AZCON C，et al.Regulation by arbuscular mycorrhizae of the integrated physiological response to salinity in plants:new challenges in physiological and molecular studies［J］.Journal of Experimental Botany，2012，63:4033-4044.

［9］ MAUREL C，CHRISPEELS M J.Aquaporins:a molecular entry into plant water relations［J］.Plant Physiology，2001，125:135-138.

［10］ UEHLEIN N，LOVISOLO C，SIEFRITZ F，et al.The tobacco aquaporin NtAQP1 is a membrane CO2pore with physiological functions［J］.Nature，2003，425:734-737.

［11］ SADE N，GEBRETSADIK M，SELIGMANN R，et al.The role of tobacco Aquaporin1 in improving water use efficiency，hydraulic conductivity，and yield production under salt stress［J］.Plant Physiology，2010，152:245-254.

［12］ JOHANSSON I，KARLSSON M，JOHANSON U，et al.The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance［J］.Biochem Biophys Acta，2010，1465:324-342.

［13］ SAKURAI J，ISHIKAWA F，YAMAGUCHI T，et al.Identification of 33 rice aquaporin genes and analysis of their expression and function［J］.Plant Cell Physiology，2005，46:1568-1577.

［14］ CHAUMONT F，BARRIEU F，WOJCIK E，et al.Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize［J］.Plant Physiology，2001，12:1206-1215.

［15］ KALDENHOFF R，F(xiàn)ISCHER M.Aquaporins in plants［J］.Acta Physiology，2006，187:169-176.

［16］ HORIE T，KANEKO T，SUGIMOTO G，et al.Mechanisms of water transport mediated by PIP aquaporins and their regulation via phosphorylation events under salinity stress in barley roots［J］.Plant Cell Physiology，2011，52:663-675.

［17］ BIENERT G P，SCHJOERRING J K，JAHN T P.Membrane transport of hydrogen peroxide［J］.Biochem Biophys Acta，2006，1758:994-1003.

［18］ GAO Z X，HE X L，ZHAO B C，et al.Overexpressing a putative aquaporin gene from wheat，TaNIP，enhances salt tolerance in transgenic Arabidopsis［J］.Plant Cell Physiology，2010，51:767-775.

［19］ HU W，YUAN Q，WANG Y，et al.Overexpression of a wheat aquaporin gene，TaAQP8，enhances salt stress tolerance in transgenic tobacco［J］.Plant Cell Physiology，2012，53:2127-2141.

［20］ ZHOU S，HU W，DENG X.Overexpression of the wheat aquaporin gene，TaAQP7，enhances drought tolerance in transgenic tobacco［J］.PLoS One，2012，7(12):e52439.