小檗堿對(duì)酒精所致心肌細(xì)胞凋亡的影響研究

劉 慧，朱俐俐，李 玲

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，中國(guó)人民解放軍第163 醫(yī)院綜合內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410003)

隨著生活質(zhì)量的提高，酒成了人們必不可少的飲品，一般一次大量攝入酒精或長(zhǎng)時(shí)間攝入才會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生嚴(yán)重影響，所以人們很大程度上忽視了酒精對(duì)人體的損傷。隨著飲酒量的增加，可出現(xiàn)明顯的心肌損傷，導(dǎo)致心功能障礙，猝死風(fēng)險(xiǎn)很高［1］。大量研究發(fā)現(xiàn)小檗堿(berberine，BBR)對(duì)心血管有多種藥理作用，關(guān)于小檗堿用于擴(kuò)血管、抗心律失常、抗心力衰竭、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用多有報(bào)道［2］，但對(duì)酒精性心肌損傷的干預(yù)尚未見報(bào)道。本研究在建立酒精性心肌損傷大鼠模型的同時(shí)予以小檗堿干預(yù)，探討小檗堿對(duì)酒精引起心肌凋亡的影響及可能機(jī)制。為小檗堿預(yù)防酒精性心肌損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

成年雄性SD 大鼠SPF 級(jí)30 只，體重約250 ～300g，購(gòu)自中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)部。56%白酒(北京紅星股份有限公司生產(chǎn)的紅星二鍋頭酒)，小檗堿20 mg /片(東北制藥總廠生產(chǎn))，cTnT 試劑盒(美國(guó)Boehringer Mannheim 公司)、CPK(南京建成生物有限公司產(chǎn)品)、CRP 試劑盒(北京科美生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

將成年雄性SD 大鼠34 只隨機(jī)分為3 組，對(duì)照組10 只，酒精組12 只，保護(hù)組12 只，酒精組及保護(hù)組予以用56%白酒灌胃，第1 周每天給酒5mL/kg，1 次灌胃，同時(shí)給予10%的乙醇隨意飲用;第2 周每天給酒10 mL/kg，分2 次灌胃，同時(shí)給予10%的乙醇隨意飲用;第3 周每天給酒10 mL/kg，分2 次灌胃，同時(shí)給予20%的乙醇隨意飲用;第4 周每天給酒15 mL/kg，分3 次灌胃，同時(shí)給予20%乙醇隨意飲用，直至12 周，對(duì)照組給予等量蒸餾水灌胃，保護(hù)組同時(shí)予以小檗堿200 mg/kg/d 灌胃12 周。12 周后取大鼠腹腔干血，低溫離心，制備血清，采用全自動(dòng)生化分析儀系統(tǒng)檢測(cè)血清中CK、乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)CRP 的含量，酶聯(lián)免疫法測(cè)定CTnT 水平。取大鼠心臟中段，10%甲醛溶液固定，做常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行HE 染色，觀察心肌病理學(xué)變化。剪取50 ～80mg 大鼠心臟組織放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，按步驟加入各試劑，提取各組心肌組織總RNA。將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，將待測(cè)樣品和內(nèi)參樣品同時(shí)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，根據(jù)待測(cè)樣品和內(nèi)參樣品擴(kuò)增產(chǎn)物電泳灰度的比值估算其mRNA 表達(dá)的相對(duì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0 軟件，所得數(shù)據(jù)均用mean ±SD表示，多個(gè)樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩組間的比較采用t 檢驗(yàn)，均數(shù)之間兩兩比較采用q 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清CTnT、CK、CRP 含量的比較

與對(duì)照組相比較，酒精組血清CTnT、CK、CRP含量增多(P ＜0.05);與酒精組對(duì)比，保護(hù)組血清CTnT、CK、CRP 含量減少(P ＜0.05)(見表1)。

表1 大鼠血清CTnT、CK、CRP 含量

2.2 各組心肌病理組織學(xué)改變

正常對(duì)照組顯微鏡下心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞漿紅潤(rùn)，細(xì)胞核完整，排列整齊，心肌纖維排列正常、無(wú)斷裂，無(wú)細(xì)胞間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。酒精組顯微鏡下與正常組比較心肌細(xì)胞不均勻肥大、延伸、變形，核大，心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)纖維化，可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。保護(hù)組顯微鏡下部分心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，心肌間質(zhì)未見明顯纖維化，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

圖1 對(duì)照組、酒精組及保護(hù)組心臟病理切片HE 染色(×400)

2.3 各組大鼠心肌組織Bcl-2 及Bax 的mRNA 水平檢測(cè)

由表2、圖2、3 可見，與對(duì)照組比較，酒精組大鼠心肌組織Bcl-2 表達(dá)水平增加不明顯，Bax 表達(dá)水平顯著增高(P ＜0.05)，Bcl-2/Bax 比值減小(P ＜0.05);保護(hù)組與酒精組比較，心肌組織Bcl-2 表達(dá)水平增強(qiáng)(P ＜0. 05)，Bax 表達(dá)水平減弱(P ＜0.05)，Bcl-2/Bax 比值增大(P ＜0.05)。

表2 心肌組織Bcl-2 及Bax 的mRNA 水平檢測(cè)結(jié)果

圖2 Bcl-2 mRNA 在各組心肌中的表達(dá)

圖3 Bax mRNA 在各組心肌中的表達(dá)

3 討論

乙醛是乙醇的代謝產(chǎn)物，可通過(guò)損傷線粒體功能、降低肌絲Ca2+通道敏感性、氧化損傷及等造成心肌的損害［3］。CK 主要存在骨骼肌、心肌和腦組織中，血清中的肌酸磷酸激酶升高，說(shuō)明組織中有細(xì)胞壞死。CTnT 是主要分布于心肌內(nèi)部，當(dāng)心肌存在炎癥或損傷，它釋放入血液，是診斷心肌損傷最高的標(biāo)志物。CRP 是組織損傷的一種非特異性反應(yīng)，在正常血清中其含量極微，當(dāng)組織受到損傷、炎癥、感染或腫瘤破壞時(shí)CRP 可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)急劇上升?，F(xiàn)大部分研究表明CRP 參與了動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病，對(duì)心血管疾病的危險(xiǎn)評(píng)估有著很強(qiáng)的預(yù)示作用。本實(shí)驗(yàn)所得心肌損傷指標(biāo)CTnT、CK、CRP 含量在酒精組顯著增高，而保護(hù)組上述指標(biāo)只有輕度升高，說(shuō)明12 周時(shí)酒精可造成心肌的損害，且小檗堿適當(dāng)?shù)臏p輕了酒精所造成的心肌損傷［4-7］。

HE 染色可見，酒精組大鼠心肌細(xì)胞不均勻肥大，核大，心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞變性。與酒精組比較，保護(hù)組大鼠心肌結(jié)果有明顯改善，顯微鏡下肌纖維較規(guī)則，部分心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，只有少量心肌間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)小檗堿對(duì)酒精所導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)損傷有保護(hù)及重塑作用。

細(xì)胞凋亡是指在活體組織中某些細(xì)胞在一定體內(nèi)外因素影響下通過(guò)其自身基因調(diào)控而發(fā)生的一種細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。有研究表明，即使早期無(wú)明顯心肌受損，凋亡前機(jī)制也已被激活［8］。由于細(xì)胞凋亡和缺失，心肌重塑，則出現(xiàn)隨后的心肌細(xì)胞肥大，心臟代償性增大，心功能降低［9-10］。Bcl-2 是早期的抗凋亡基因，是制約細(xì)胞凋亡的重要因素，存在于核膜、線粒體膜及細(xì)胞膜的表面，能和家族成員凋亡相關(guān)基因Bax 形成異源二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，Bcl-2/Bax 基因的比值可用于評(píng)判細(xì)胞凋亡的程度［11-12］。本實(shí)驗(yàn)可見酒精組凋亡相關(guān)基因Bax mRNA 表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，Bcl-2 與Bax 比值較對(duì)照組明顯降低，凋亡發(fā)生率明顯高于對(duì)照組，表明酒精可通過(guò)加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax 的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。與酒精組比較，保護(hù)組凋亡相關(guān)基因Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，Bcl-2/Bax 比值較酒精組升高，說(shuō)明保護(hù)組細(xì)胞凋亡的發(fā)生率比酒精組低，小檗堿可通過(guò)作用抗凋亡蛋白的表達(dá)而減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，慢性酒精攝取可以引起心肌細(xì)胞的凋亡，且心肌細(xì)胞的凋亡與Bcl-2、Bax 的表達(dá)有關(guān)，小檗堿可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax 的表達(dá)從而起到保護(hù)心肌的作用，但是小檗堿如何啟動(dòng)Bcl-2、Bax 的表達(dá)及其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

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