過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立

田 軍，朱龍飛，堅(jiān) 哲，劉邦民，李 強(qiáng)，李春英，高天文

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為皮損處色素消失[1]。目前，關(guān)于白癜風(fēng)的病因尚不清楚，其皮損處黑素細(xì)胞被破壞的機(jī)制也較復(fù)雜[2]。因此，了解和掌握白癜風(fēng)具體發(fā)病機(jī)制對(duì)預(yù)防和治療白癜風(fēng)具有重要的意義。以往研究認(rèn)為，白癜風(fēng)的發(fā)生與遺傳、內(nèi)分泌、自身免疫等諸多因素有關(guān)，近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示氧化應(yīng)激在其發(fā)病中起關(guān)鍵作用，而通常認(rèn)為起關(guān)鍵作用的自身免疫因素則可能是氧化應(yīng)激導(dǎo)致黑素細(xì)胞被破壞后的繼發(fā)現(xiàn)象[3]。氧化應(yīng)激可以產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species, ROS），它包括各種氧自由基，其中H2O2是主要成員，它可以直接或間接的損傷細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死[4]。有研究表明，H2O2的過(guò)量蓄積是氧化應(yīng)激參與白癜風(fēng)發(fā)病最直接的證據(jù)之一[5]。然而由于缺乏合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停壳鞍遵帮L(fēng)的研究較為困難。因此，我們采用人永生化黑素細(xì)胞系PIG1 為研究對(duì)象，以H2O2作為誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷的因素，建立體外模擬 ROS 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的細(xì)胞模型，為研究白癜風(fēng)氧化應(yīng)激發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人永生化黑素細(xì)胞系PIG1 由美國(guó)芝加哥大學(xué)Caroline Le Poole 教授饋贈(zèng)，254 培養(yǎng)基（Invitrogen公司），胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco BRL 公司），CCK-8 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒及ROS 檢測(cè)試劑盒（碧云天公司），Annexin V-FITC / PI 細(xì)胞凋亡試劑盒（麥博公司），丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成公司），H2O2等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。倒置顯微鏡（NikonES2000），酶標(biāo)儀（BIORAD680 型），流式細(xì)胞儀FACS Calibur（BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 PIG1 細(xì)胞培養(yǎng)于含 5%胎牛血清254 培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，按 1×106/ml 密度接種于 96 孔或 6 孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁約 80%時(shí)分組處理。分別用H2O2終濃度為 0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng) PIG1 細(xì)胞24 h，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡觀察處理后各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 消化收集各組細(xì)胞，分別加入100 μl Binding Buffer 和Annexin V-FITC（20 μg/ml）10 μl，室溫避光30 min，再加入PI（50 μg/ml）5 μl，避光反應(yīng)5 min 后，加入400 μl Binding Buffer，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，以不加Annexin V-FITC 及PI 各一管作為陰性對(duì)照。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平檢測(cè) 去除已處理好的 6 孔板中培養(yǎng)基， PBS 洗滌1 次，每孔加入1 ml 按照1∶1 000 無(wú)血清254 培養(yǎng)基稀釋的ROS 熒光探針DCFH-DA，孵育20 min，棄上清后PBS 洗滌3 次，消化收集各組細(xì)胞，800 r/min，離心5 min，PBS 洗滌3 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度。

1.2.5 細(xì)胞活性檢測(cè) 向已處理好的 96 孔板每孔加入10 μl CCK-8 試劑，37 ℃，5% CO2孵箱中孵育 1 h 后，酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處各孔A 值，計(jì)算公式：細(xì)胞活性= A490(處理組)/ A490(對(duì)照組)×100% 。

1.2.6 MDA 檢測(cè) 采用硫代硫酸巴比妥法（TBARs），每組均取 1×106個(gè)處理好的細(xì)胞，3 000 r/min，離心 10 min，棄上清，在沉淀中加入 0. 6 ml 雙蒸水，置旋渦混勻器上混勻 1 min，加 0.3 ml 無(wú)水乙醇，混勻 30 s，加三氯甲烷 0.3 ml，混勻 1 min，3 500 r/min，離心 10 min 后吸取上層MDA 抽提液0. 8 ml，試劑盒檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2 處理后黑素細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

不同濃度H2O2處理后黑素細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化見圖1。倒置顯微鏡下觀察顯示正常的黑素細(xì)胞形態(tài)呈樹突狀，兩極、三極或多極，部分區(qū)域連接成網(wǎng)狀。隨著作用濃度的增加，黑素細(xì)胞體積變小，樹突數(shù)量減少，長(zhǎng)度縮短，凋亡及壞死逐漸增加。

圖1 不同濃度H2O2處理24 h后黑素細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖2 不同濃度H2O2 對(duì)人黑素細(xì)胞凋亡的影響

圖3 不同濃度H2O2 對(duì)人黑素細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

2.2 不同濃度H2O2 對(duì)PIG1 細(xì)胞凋亡情況的影響

不同濃度H2O2對(duì)PIG1 細(xì)胞凋亡情況的影響見圖2。流式細(xì)胞儀凋亡分析結(jié)果顯示，在 0.50 mmol/L H2O2處理組黑素細(xì)胞就開始發(fā)生凋亡，隨著 H2O2濃度的增加，PIG1 細(xì)胞凋亡率逐漸增高，0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、和 2.00 mmol/L H2O2處理24 h 后， PIG1 細(xì)胞的總凋亡率分別為6.8%、11.5%、15.6%、22.7%、38.7% 和57.5%。

2.3 不同濃度H2O2 對(duì)PIG1 細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響

不同濃度H2O2對(duì)PIG1 細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響見圖3。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2對(duì) PIG1 細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響存在濃度依賴關(guān)系，隨著H2O2濃度的增加，PIG1 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平逐漸升高。以 0 mmol/L 濃度組作為對(duì)照相比，0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L H2O2處理組PIG1 細(xì)胞24 h 后平均熒光強(qiáng)度 分 別 為 （269.8±11.46）、（315.0±1.27）、（450.1±3.75）、（856.5±46.4）、（1216.0±19.2）、（1714±109.2），從1.00 時(shí)開始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.4 不同濃度H2O2 對(duì)PIG1 細(xì)胞活性的影響

不同濃度H2O2對(duì)PIG1 細(xì)胞活性的影響見表1。H2O2對(duì) PIG1 細(xì)胞活性的影響存在濃度依賴關(guān)系，隨著H2O2濃度增加，PIG1 細(xì)胞的生長(zhǎng)活力逐漸降低，從1.0 mmol/L 時(shí)開始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.5 不同濃度H2O2 對(duì)PIG1 細(xì)胞MDA 產(chǎn)生的影響

不同濃度H2O2對(duì)PIG1 細(xì)胞MDA 產(chǎn)生的影響見表2。隨著H2O2濃度的增加，PIG1 細(xì)胞MDA 產(chǎn)生量逐漸增加，從1.00 mmol/L 時(shí)開始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

表1 不同濃度H2O2 對(duì)人黑素細(xì)胞活性的影響 ±s）

表1 不同濃度H2O2 對(duì)人黑素細(xì)胞活性的影響 ±s）

注 ：與對(duì)照組比較，* P<0.05

0.50 98.0±2.02 0.412 H2O2濃度(mmol/L) 活性率(%) P值（與對(duì)照組比）0 101.7±2.61 0.75 95.2±1.83 0.050 1.00 79.7±4.28* 0.000 1.25 57.1±3.09* 0.000 1.50 46.9±1.94* 0.000 2.00 28.6±2.54* 0.000

表2 不同濃度H2O2 對(duì)人黑素細(xì)胞MDA產(chǎn)生的影響 ±s）

表2 不同濃度H2O2 對(duì)人黑素細(xì)胞MDA產(chǎn)生的影響 ±s）

注 ：與對(duì)照組比較，* P<0.05

H2O2濃度(mmol/L) MDA P值（與對(duì)照組比）0 101.7±2.61 0.50 98.0±2.02 1.000 0.75 95.2±1.83 0.512 1.00 79.7±4.28* 0.001 1.25 57.1±3.09* 0.000 1.50 46.9±1.94* 0.000 2.00 28.6±2.54* 0.000

3 討論

人體皮膚在正常情況下，表皮細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，細(xì)胞會(huì)受到自由基防御系統(tǒng)和損傷修復(fù)系統(tǒng)的雙重保護(hù)[6]。細(xì)胞有氧代謝會(huì)產(chǎn)生少量H2O2、HO- 等活性氧自由基，黑素細(xì)胞合成黑素的過(guò)程中及紫外線的照射也會(huì)引起表皮 H2O2的蓄積。H2O2可產(chǎn)生羥自由基，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，還可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜和核膜，因此對(duì)細(xì)胞的損傷最大。皮膚在受到外源性毒物、藥物或各種有害刺激時(shí)亦可產(chǎn)生大量的氧自由基，當(dāng)自由基的產(chǎn)生超出機(jī)體清除能力時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[7]。目前大量研究表明白癜風(fēng)的發(fā)生與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，其中最直接最有力的證據(jù)就是有國(guó)外學(xué)者在進(jìn)展期白癜風(fēng)患者表皮中檢測(cè)到了過(guò)量蓄積的H2O2[5]。

通過(guò)查閱以往的文獻(xiàn)，筆者選擇了6 個(gè)H2O2處理濃度 (0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L) 和作用時(shí)間 (24 h)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2處理濃度的升高，黑素細(xì)胞活性逐漸下降，細(xì)胞凋亡比率逐漸升高，細(xì)胞內(nèi)ROS 和MDA 產(chǎn)生逐漸增加，存在著明顯的劑量依賴關(guān)系。1.00 mmol/L 的H2O2作用于PIG1 細(xì)胞 24 h 后，細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)ROS 及MDA水平改變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)細(xì)胞凋亡率也不高，這說(shuō)明在此濃度作用下細(xì)胞既可以產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)又不至于死亡過(guò)多，還可進(jìn)行下一步的干預(yù)和培養(yǎng)，因此我們確定1.00 mmol/L 的H2O2處理24 h 為最佳實(shí)驗(yàn)濃度。

在H2O2復(fù)制的人黑素細(xì)胞氧化性損傷模型中，細(xì)胞的氧化損傷較為明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞活性下降，細(xì)胞凋亡比率增加，細(xì)胞內(nèi)ROS 及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 含量均增高。細(xì)胞活性下降和凋亡比率升高是H2O2對(duì)細(xì)胞造成不可逆損傷的充分體現(xiàn)；ROS 水平直接反映了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的程度[8]；MDA 是細(xì)胞生物膜中的不飽和脂肪酸被氧化后的代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量的多少可以反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，從而間接反映氧化應(yīng)激損傷的程度[9]。既往已有研究證實(shí)H2O2可以引起劑量依賴性細(xì)胞死亡，但濃度較低時(shí)主要導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，濃度過(guò)高則主要引起細(xì)胞壞死[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)1.00 mmol/L H2O2處理 24 h 后細(xì)胞活性開始下降，與對(duì)照組相比組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），從其他方面看1.00 mmol/L H2O2處理24 h 后對(duì)細(xì)胞的損害不大，但從細(xì)胞凋亡率來(lái)看1.00 mmol/L H2O2處理24 h 后就開始誘發(fā)了明顯的細(xì)胞凋亡和壞死，其中占主要部分的是凋亡。通過(guò)以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的增加細(xì)胞可出現(xiàn)明顯的損傷效應(yīng)，先是細(xì)胞功能的改變，損傷積累到一定程度就觸發(fā)了細(xì)胞的器質(zhì)性損害或不可逆的損傷。

以往有作者使用黑素瘤細(xì)胞系及原代黑素細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型進(jìn)行白癜風(fēng)氧化應(yīng)激損傷相關(guān)機(jī)制研究[12,13]。筆者在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)，采用人永生化黑素細(xì)胞系PIG1 作為建模對(duì)象，其具有完善的黑素代謝功能及其他生物學(xué)特性[14]，更接近于人原代黑素細(xì)胞，因而具有較強(qiáng)特異性；也能最大限度的克服原代黑素細(xì)胞因取材個(gè)體年齡等異質(zhì)性而導(dǎo)致的誘導(dǎo)條件不穩(wěn)定，因而具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性；H2O2的處理濃度接近于白癜風(fēng)患者表皮中H2O2的濃度[15]，所造成的氧化損傷過(guò)程類似于體內(nèi)ROS 導(dǎo)致黑素細(xì)胞氧化損傷的病理過(guò)程，所以模擬性很強(qiáng)；另外本模型的可控性強(qiáng)，較原代培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，細(xì)胞系便于操作，易于重復(fù)。但由于該細(xì)胞系是經(jīng)人乳頭瘤病毒(HPV)-6 型病毒轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞系，其可能與原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞存在差異，因此具有一定的局限性，故用于實(shí)驗(yàn)研究時(shí)還需與原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞結(jié)合起來(lái)，相互印證，相互補(bǔ)充。

綜上所述，筆者的研究建立了H2O2誘導(dǎo) PIG1 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，本細(xì)胞氧化損傷模型簡(jiǎn)易，經(jīng)濟(jì)，便于推廣，能較好地模擬氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，為從細(xì)胞水平深入研究黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)疾病提供了良好的模型支持。

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