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    有機氯農(nóng)藥與牛血清白蛋白作用機理研究

    2014-12-23 01:05:30李慧芳
    應用化工 2014年2期
    關(guān)鍵詞:有機氯常數(shù)白蛋白

    李慧芳

    (煙臺大學 文經(jīng)學院,山東 煙臺 264005)

    有機氯農(nóng)藥(Organohlorine pestcides,OCPs)主要包括氯代脂環(huán)族碳氫化合物和氯代芳香族化合物。前者以六六六及其異構(gòu)體、艾氏劑、狄氏劑及其異構(gòu)體、氯丹及其異構(gòu)體、七氯等為代表,后者以DDT 及其異構(gòu)體、六氯苯等為代表。有機氯農(nóng)藥結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,對富含脂肪的組織具有特殊親和力,在自然界不易降解,可通過生物富集作用蓄積于生物體內(nèi)。有研究表明,有機氯農(nóng)藥和血漿蛋白質(zhì)能產(chǎn)生一定的結(jié)合作用[1],并可直接影響到藥物在生物體內(nèi)的分布和消除[2-3]。且就我們所知,還未見有機氯和血漿蛋白結(jié)合作用機理的研究報道。

    血漿中含有幾種轉(zhuǎn)運蛋白,但只有白蛋白與異源物親和性較強[4]。血清白蛋白作為脊椎動物血漿中最為豐富的蛋白質(zhì),在藥物分布和療效上起著重要的作用,并且藥物和白蛋白之間的作用可引起蛋白的構(gòu)象改變[2,5-6]。迄今為止,與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用研究多集中于人血清白蛋白[4,7]、牛血清白蛋白[4,8]和魚血清白蛋白[9-10]等。本實驗選擇廉價易得的BSA 為例來研究OCPs 和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用。BSA 的氨基酸殘基在吸收了280 nm 波長的激發(fā)光后會發(fā)射出相應的熒光,當向血清白蛋白體系中加入一些小分子物質(zhì)時則能引起氨基酸殘基的熒光猝滅。分子熒光光譜法可用來測量這種猝滅現(xiàn)象,從而推斷白蛋白和藥物之間的結(jié)合作用機理[4,7-10]。本文旨在利用分子熒光光譜法研究5 種有機氯農(nóng)藥(δ-BHC、α-氯丹、HCB、Aldrin、o,p'-DDT)與BSA 之間的結(jié)合作用機理,推斷農(nóng)藥小分子在動物體內(nèi)的存在形態(tài),與蛋白質(zhì)結(jié)合能力的大小,為研究有機氯的毒理學提供理論依據(jù)。

    1 實驗部分

    1.1 材料與儀器

    δ-BHC、α-氯丹、HCB、艾氏劑、o,p'-DDT 等5 種有機氯農(nóng)藥均為工業(yè)品,純度97.0% ~99.0%;牛血清白蛋白(BSA),購于北京軍區(qū)獸醫(yī)防治中心生物工程研究室,純度>98%。

    Cary Eclipse 熒光分光光度計,配有恒溫裝置和1.00 cm 石英比色池。

    1.2 試液配制

    牛血清白蛋白用pH 為7.4 的Tris-HCl 緩沖溶液配制為1 μmol/L 的標準溶液。5 種有機氯類農(nóng)藥分別用正己烷配制成一定濃度的單標溶液,于-20 ℃保存?zhèn)溆?然后α-氯丹、δ-六六六、艾氏劑、o,p'-DDT 和六氯苯分別用甲醇配制成濃度為2.44×10-7,2.85 ×10-6,1.48 ×10-4,1.41 ×10-4,3.51×10-4mol/L 的工作液。

    1.3 熒光光譜分析

    比色池中加入3 mL 牛血清標準溶液,待恒溫后,用可調(diào)式微量注射器向石英比色池中依次加入5,10,15……45,50 μL 的OCPs 溶液,磁力攪拌混勻。在測定光譜通帶Δλ =5 nm、激發(fā)波長λex=280 nm、發(fā)射波長λmx=345 nm 條件下,分別掃描25,37 ℃下不同OCPs-BSA 體系的熒光光譜。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 OCPs 猝滅BSA 的熒光光譜

    圖1 25 ℃和37 ℃下α-氯丹對BSA 的猝滅譜圖Fig.1 Effect of α-chlordane on fluorescence spectra of BSA at 25 ℃and 37 ℃

    280 nm 波長激發(fā)下,BSA 溶液能發(fā)出熒光,主要歸結(jié)于色氨酸殘基[11]。從色氨酸發(fā)射光譜的變化可推測蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變、亞基締合、底物結(jié)合或者變性現(xiàn)象[11-12]。所以,蛋白質(zhì)的固有熒光可提供有關(guān)結(jié)構(gòu)和動力學信息,以研究蛋白質(zhì)的折疊和結(jié)合反應[4]。實驗選取了α-氯丹、δ-六六六、艾氏劑、o,p'-DDT 和六氯苯這5 種極性不同的OCPs 作為代表,研究有機氯與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用。在BSA 濃度不變的情況下,隨著OCPs 濃度的增加,BSA 的熒光峰位及峰形基本保持不變,但其熒光強度卻有規(guī)律地降低,這表明該類農(nóng)藥和BSA 之間存在相互作用。25 ℃和37 ℃時OCPs 對BSA 的猝滅譜圖分別見圖1(以α-氯丹為代表)。

    2.2 OCPs 對BSA 的猝滅類型

    熒光猝滅可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅,前者是指處于激發(fā)態(tài)的熒光物質(zhì)與猝滅劑發(fā)生碰撞后能量損失,從而在返回基態(tài)時沒有熒光產(chǎn)生;后者是指熒光物質(zhì)在基態(tài)與猝滅劑形成不發(fā)熒光的締合物[4]。動態(tài)猝滅通常符合Srern-Volmer 方程,靜態(tài)猝滅過程只有在猝滅劑與熒光物質(zhì)之間形成1∶1 配合物時才符合該方程[11]:

    式中,F(xiàn)0為不存在猝滅劑時BSA 的熒光強度;F 為猝滅劑加入后BSA 的熒光強度;Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)(當Kq>1012,一般為靜態(tài)猝滅過程);τ0為不存在猝滅劑時測得的熒光壽命(τ0≈10-8s);KSV為Stern-Volmer 猝滅常數(shù);[Q]為OCPs 濃度。

    實驗分別測定25 ℃及37 ℃下BSA 的熒光強度F0/F 隨OCPs 濃度的變化,并利用Stern-Volmer擬合曲線表明,BSA 的熒光強度比值F0/F 與5 種OCPs 濃度呈良好的線性關(guān)系(見圖2)。BSA 與5種OCPs 的Stern-Volmer 擬 合 方 程、KSV和Kq列于表1。

    表1 BSA 與5 種OCPs 藥物的Stern-Volmer 回歸方程及猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer equations and quenching constants of OCPs on BSA

    由表1 可知,5 種OCPs 的Kq均大于1012,故可以 推斷5 種OCPs 猝滅BSA 的過程均為靜態(tài)猝滅過程。

    圖2 25 ℃和37 ℃下5 種OCPs 藥物對BSA 的Stern-Volmer 曲線圖Fig.2 Stern-Volmer plots of BSA titrated against 5 OCPs at 25 ℃and 37 ℃

    2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合點位數(shù)

    對于靜態(tài)猝滅,熒光強度與猝滅劑濃度之間遵循以下關(guān)系式[13-14]:

    式中,F(xiàn)0為未加藥物時BSA 的熒光強度,F(xiàn) 表示藥物濃度為[Q]時BSA 的熒光強度,K 為結(jié)合常數(shù),n為結(jié)合位點數(shù),即一個BSA 分子可結(jié)合的藥物分子的數(shù)目。改變OCPs 的藥物濃度,BSA 的熒光強度將發(fā)生變化,將log[(F0-F)/F]對log[Q]作圖,得到了良好的線性關(guān)系(見圖3),然后可通過斜率和截距求出藥物小分子與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合常數(shù)K及結(jié)合位點數(shù)n。5 種OCPs 與BSA 的結(jié)合常數(shù)K及結(jié)合位點數(shù)n 見表2。

    由表2 可知,5 種OCPs 與BSA 的結(jié)合常數(shù)大小順序為α-氯丹>δ-BHC >艾氏劑>o,p'-DDT >HCB,說明5 種農(nóng)藥中α-氯丹結(jié)合BSA 的能力相對最強,HCB 結(jié)合BSA 的能力最弱;5 種OCPs 與BSA的結(jié)合點位數(shù)都近似為1,說明一個BSA 分子可結(jié)合一個有機氯分子。當溫度從25 ℃提高到37 ℃,結(jié)合常數(shù)也隨之增加,說明適當增加溫度有助于BSA 與OCPs 的結(jié)合。

    圖3 log [(F0-F)/F]與log[Q]關(guān)系曲線Fig.3 Plots of log[(F0-F)/F]vs log[Q]at 25 ℃and 37 ℃

    表2 OCPs 與BSA 作用的平衡常數(shù)K0和結(jié)合點位數(shù)nTable 2 The equilibrium constants K0 and binding sites n of BSA-OCPs systems

    2.4 OCPs 和BSA 作用力的確定

    由不同溫度下的K 值,利用van’t Hoff 方程[式(3)和式(4)],可獲得OCPs 與BSA 相互作用的焓變ΔH、自由能變ΔG 和熵變ΔS(見表3)。

    藥物小分子與生物大分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、疏水作用力和靜電引力等非共價作用力。根據(jù)反應的熱力學常數(shù)可大致確定作用力類型[15]:ΔH >0,ΔS >0,主要表現(xiàn)為疏水作用力;ΔH <0,ΔS <0 時,主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力;ΔH≈0,ΔS >0,主要表現(xiàn)為靜電引力。

    由表3 可推斷,25 ℃和37 ℃時,對于δ-BHC、α-氯丹、艾氏劑、o,p'-DDT、HCB 這5 種POPs 農(nóng)藥,ΔH >0,ΔS >0,說明5 種OCPs 與BSA 之間的相互作用主要表現(xiàn)為一個熵增加、以疏水作用力為主的過程。

    表3 OCPs 與BSA 作用的熱力學參數(shù)Table 3 The thermodynamic parameters of the BSA-OCPs procedures

    3 結(jié)論

    通過熒光光譜法測得5 種OCPs 均是較溫和的猝滅劑,對BSA 的熒光猝滅都屬于靜態(tài)猝滅,有機氯分子與蛋白質(zhì)分子可通過較弱的疏水作用力1∶1相互結(jié)合,而且5 種OCPs 相對而言,α-氯丹的結(jié)合能力最強,HCB 的結(jié)合能力最弱;雖然不同的有機氯分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合強度有所不同,但都會隨著溫度的升高而加強。

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