射麻口服液治療新型冠狀病毒肺炎作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討

封繼宏 譚旺曉 張 碩 金世元 畢明達 秦云普 趙 坤

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193；3.北京市衛(wèi)生學(xué)校，北京 100053；4.海南中盛合美生物制藥有限公司，海南?？?570100

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是指感染2019 新型冠狀病毒（SARSCoV-2）引起的肺炎，主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽、肌痛或疲勞，主要通過呼吸道飛沫和接觸傳播[1]。其迅速蔓延至全國及世界其他地區(qū)，對人民的生命財產(chǎn)及社會的穩(wěn)定造成了嚴(yán)重的影響[2]。目前全球疫情仍未得到有效控制，尚無針對COVID-19 的特效藥，而我國中西結(jié)合療效顯著，為全球提供了中醫(yī)藥抗疫經(jīng)驗[3]。

射麻口服液是在《傷寒雜病論》麻杏石甘湯的基礎(chǔ)上加減而成，由麻黃、膽南星、石膏、桑白皮、射干、萊菔子、苦杏仁、白前、黃芩、五味子組成，具有清肺化痰、止咳平喘的功效。在抗擊COVID-19 疫情中，《福建省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)診療專家共識》[4]、《北京市新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥防治方案（試行第四版）》[5]均將射麻口服液列為推薦中成藥。因此，研究射麻口服液治療COVID-19 的作用機制對指導(dǎo)其臨床應(yīng)用具有重要意義。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步探討射麻口服液治療COVID-19 可能的作用機制，為其更廣泛地用于治療COVID-19 提供理論依據(jù)，并為更加深入地理解中醫(yī)藥防治COVID-19 提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 資料

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（https：//www.genecards.org/）、STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）和蛋白質(zhì)靶點數(shù)據(jù)庫Uniprot（http：//www.uniprot.org/）；網(wǎng)絡(luò)分析工具Cytoscape 3.7.2 和IPA 分析軟件（http：// www.ingenuity.com）。

1.2 射麻口服液活性成分及作用靶點篩選

利用TCMSP 檢索射麻口服液中麻黃、天南星、石膏、桑白皮、射干、萊菔子、苦杏仁、白前、黃芩、五味子的化學(xué)成分，檢索時間截至2020 年3 月25 日；并以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為參數(shù)篩選活性化合物。通過TCMSP 數(shù)據(jù)查詢活性化合物的作用靶點，借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫對靶點進行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 疾病靶點收集

基于GeneCards 數(shù)據(jù)庫，以“novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲取COVID-19 相關(guān)的靶基因，檢索時間截至2020 年4 月2 日。

1.4 射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點預(yù)測

將射麻口服液的作用靶點和COVID-19 的靶點進行映射，篩選出共同靶點，作為射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點。

1.5 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.4”中得到的潛在作用靶點及其相對應(yīng)的活性成分和成分對應(yīng)的中藥導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，采用Network Analyzer 功能對網(wǎng)絡(luò)進行分析。

1.6 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

在STRING 數(shù)據(jù)庫中輸入射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點，進行PPI 分析，利用Cytoscape 3.7.2 軟件進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并通過CytoHubba 功能對節(jié)點的度值（Degree 值）進行分析，提取關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)。

1.7 靶點功能及通路富集分析

將靶點上傳至IPA 進行Core Analysis，采用STRING 數(shù)據(jù)庫對潛在作用靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 射麻口服液的活性成分及作用靶點

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索射麻口服液中10 味中藥的化學(xué)成分，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18 篩選出活性化合物148 個，見圖1A。去重后得到106 個活性成分，按照OB 值排名前20 的活性成分見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫匹配到853 個作用靶點，每味中藥對應(yīng)靶點數(shù)見圖1B。靶點去重并進行標(biāo)準(zhǔn)化后得到265 個靶點。

圖1 射麻口服液活性成分及對應(yīng)靶點數(shù)量

表1 射麻口服液中OB 值前20 的活性成分基本信息

2.2 射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索得到COVID-19 相關(guān)靶點259 個，將其與射麻口服液的作用靶點取交集，得到53 個共同靶點。見圖2。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖3。采用Network Analyzer 對網(wǎng)絡(luò)進行分析，按照Degree 值定義節(jié)點的大小，如圖3 所示，其中槲皮素（MOL000098）、β-谷甾醇（MOL000358）、木犀草素（MOL000006）、山奈酚（MOL000422）、漢黃芩素（MOL000173）、豆甾醇（MOL000449）、柚皮素（MOL004328）、金合歡素（MOL001689）、黃芩素（MOL 002714）均能與10 個以上的靶點連接，而在53 個潛在作用靶點中，PTGS2、PTGS1、NOS2、DDP4、PIK3CG、CASP3、BCL2、MAPK14、RELA 等靶點又能與10 個以上的成分連接。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖2 射麻口服液作用靶點和COVID-19 靶點交集

圖3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

使用STRING 平臺對53 個潛在作用靶點進行分析，用Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4（封三）。圖中節(jié)點面積、顏色表示靶點的Degree 值大小，面積越大、顏色越趨于暖色的節(jié)點對應(yīng)靶蛋白的Degree 值越高；邊的粗細(xì)、顏色表示連接評分，邊越粗、顏色越趨于冷色評分越高，關(guān)系越密切，節(jié)點之間的邊數(shù)越多表示靶點之間的關(guān)聯(lián)度越大。同時運用CytoHubba 插件對靶點的Degree 值進行排序，篩選出Degree 值≥30 的靶蛋白14 個，包括MAPK3、TP53、TNF、IL -6、MAPK8、CASP3、MAPK1、IL -10、CXCL8、CCL2、MAPK14、PTGS2、IL-1B、IL-4，并提取關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，見圖5。Degree 值大的靶點在網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，說明這14 個靶蛋白是PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心靶點。

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 蛋白相互作用關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點功能分析

IPA 分析得到500 條靶點相關(guān)的疾病和生物學(xué)功能信息，按照P 值排序，主要涉及細(xì)胞死亡和存活（cell death and survival）、機體損傷和異常（organismal injury and abnormalities）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運（immune cell trafficking）等。見圖6。

圖6 射麻口服液治療COVID-19 潛在靶點的疾病與生物功能熱圖

2.6 靶點通路分析

KEGG 富集分析得到169 條信號通路，主要涉及微生物感染、炎癥應(yīng)答、氧化還原等生物過程。前20 條通路中共有14 條通路與免疫炎癥、病毒感染、細(xì)菌和寄生蟲感染相關(guān)，主要涉及白細(xì)胞介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、甲型流感（influenza A）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、肺結(jié)核（tuberculosis）等信號通路，此外還涉及缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、凋亡通路（Apoptosis）及癌癥相關(guān)通路，見圖7（封三），其中綠色字體為免疫炎癥相關(guān)通路。

圖7 射麻口服液治療新型冠狀病毒肺炎的KEGG 通路富集氣泡圖

為了進一步探究射麻口服液的作用機制，將與免疫炎癥、病毒感染、細(xì)菌和寄生蟲感染相關(guān)的14 條信號通路和對應(yīng)的40 個靶蛋白導(dǎo)入Cytoscape 構(gòu)建靶點-信號通路作用網(wǎng)絡(luò)，見圖8（封四）。根據(jù)Degree 值調(diào)節(jié)靶蛋白的大小和顏色，面積越大、顏色越深的靶蛋白Degree 值越大，即在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。如圖所示，篩選出TNF、IL-6、RELA、MAPK8、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL1B、CXCL8 等9 個主要靶蛋白，均參與調(diào)節(jié)10 條以上的信號通路，并且均與白細(xì)胞介素-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路和NOD 樣受體信號通路有關(guān)。而在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，MAPK3、TNF、IL6、TP53、CASP3、MAPK8、IL10、CXCL8、PTGS2、MAPK1、CCL2、IL1B、MAPK14、IL4 是網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點，兩組靶點映射，推測除了PTGS2、PTGS1、NOS2、DDP4、PIK3CG、CASP3、BCL2、MAPK14、RELA 外，射麻口服液還可能通過調(diào)節(jié)MAPK3、TNF、IL6、MAPK8、CXCL8、MAPK1、IL1B 等靶點發(fā)揮治療COVID-19 的作用。

3 討論

中醫(yī)藥防治瘟疫具有悠久的歷史，總結(jié)了大量的臨床用藥經(jīng)驗。自COVID-19 疫情發(fā)生以來，中醫(yī)藥治療效果顯著。射麻口服液作為福建、北京等地區(qū)防治方案的推薦用藥，可用于治療以咳嗽、痰多稠黏、胸悶憋氣等為主要癥狀的COVID-19 疫毒襲肺證。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究射麻口服液治療COVID-19的作用機制。

通過構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、豆甾醇、黃芩素等在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)聯(lián)度較高。已有研究表明，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、黃芩素均能與SARS-CoV-2 3CL 水解酶和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ較好地結(jié)合，其結(jié)合能力與治療COVID-19的臨床推薦用化學(xué)藥瑞德西韋、利托那韋等相近，甚至優(yōu)于化學(xué)藥[6-7]，說明這些化合物可能是射麻口服液治療COVID-19 的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究表明槲皮素可降低炎癥因子IL-6 和IL-1β 的釋放[8]，改善肺纖維化[9]。木犀草素具有較強的體外抑制流感病毒的活性[10]，并可減輕LPS 誘導(dǎo)的支氣管肺炎損傷[11]。山奈酚可防治甲型流感病毒誘導(dǎo)的肺內(nèi)屏障功能障礙[12]，而黃芩素和漢黃芩素可改善甲型流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷[13]。以上研究結(jié)果提示，射麻口服液的活性成分具有抗病毒、抗炎、保護肺臟的作用，其可能通過多種成分的協(xié)同作用改善COVID-19 引起的炎癥反應(yīng)及肺損傷。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及深入的靶點-通路網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，MAPK3、TNF、IL-6、MAPK8、CXCL8、MAPK1、IL-1B等靶點可能是射麻口服液作用的核心靶點。當(dāng)機體感染微生物或受到其他外界強烈刺激后，免疫系統(tǒng)被過度激活，從而引起多種細(xì)胞因子迅速大量產(chǎn)生而誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，即炎癥風(fēng)暴[14]。研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者體內(nèi)存在強烈的免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴，失控的炎癥風(fēng)暴是造成肺損傷及肺炎發(fā)生發(fā)展的重要原因[15]。而促炎性細(xì)胞因子IL-6 是引發(fā)炎癥風(fēng)暴的關(guān)鍵炎癥因子之一，重癥患者體內(nèi)IL-6 的水平明顯升高[16-17]。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[18]已將IL-6 作為重型、危重型COVID-19 患者的臨床預(yù)警指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6 可能是射麻口服液治療COVID-19 的潛在作用靶點，木犀草素、槲皮素、漢黃芩素等成分均可作用于IL-6，提示射麻口服液可能通過抑制IL-6 進而阻斷炎癥風(fēng)暴，從而阻止患者向重型、危重型轉(zhuǎn)變。TNF、IL-1B 等炎癥因子均參與細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生發(fā)展，臨床報道COVID-19 患者體內(nèi)TNF-α、IL-1B 的水平也顯著升高[15]，提示抑制TNF-α、IL-1B 等炎癥因子的釋放亦是阻斷炎癥風(fēng)暴的有效手段。因此，射麻口服液可能通過調(diào)節(jié)IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子的釋放，影響炎癥風(fēng)暴的發(fā)生發(fā)展，從而發(fā)揮治療COVID-19 的作用。

KEGG 富集分析得到169 條信號通路，主要涉及微生物感染、炎癥應(yīng)答、氧化還原等生物過程。進一步分析發(fā)現(xiàn)，前20 條通路中，4 條通路與免疫炎癥相關(guān)，10 條通路與病毒感染、細(xì)菌和寄生蟲感染相關(guān)，說明射麻口服液在抗病毒感染、調(diào)節(jié)炎癥方面具有重要的作用，可能是其抗COVID-19 的原因。通過靶點-通路分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點主要富集在IL-17、Toll 樣受體和NOD 樣受體信號通路。IL-17 對宿主的免疫反應(yīng)至關(guān)重要[19]，膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷患者IL-17的含量明顯升高，阻斷IL-17 信號通路可以降低肺部炎癥反應(yīng)改善肺損傷[20-21]。TNF 在維持細(xì)胞、組織和機體內(nèi)環(huán)境平衡中起重要作用[22]，其中TNF-α 是急性病毒性疾病中關(guān)鍵的細(xì)胞因子，其可通過失控的炎癥反應(yīng)加重冠狀病毒的致病性[14]，抑制TNF-α 信號，可緩解SARS 病毒感染小鼠的組織損傷[23]。在本研究中，TNF 信號通路與射麻口服液對應(yīng)的IL-6、TNF、IL-1B等16 個靶蛋白相關(guān)。而Toll 樣受體信號通路在先天免疫應(yīng)答和抗原特異性獲得免疫中發(fā)揮著重要作用，研究表明激活Toll 樣受體信號通路可以保護流感病毒的感染[24]。本研究結(jié)果顯示，IL-17、TNF 和Toll 樣受體信號通路是射麻口服液調(diào)節(jié)的重要免疫炎癥相關(guān)通路，涉及IL-6、TNF、MAPK8、CXCL8 等核心靶點，推測射麻口服液可能通過調(diào)節(jié)這些靶點進而調(diào)控IL-17、TNF、Toll 樣受體通路抑制免疫炎癥反應(yīng)，進而改善SARS-CoV-2 感染引起的肺損傷。此外，COVID-19患者由于病毒感染引起的肺部炎癥容易導(dǎo)致機體血氧降低，嚴(yán)重則可引發(fā)低氧血癥[15]。當(dāng)機體缺氧時HIF-1 被活化，介導(dǎo)缺氧代償性反應(yīng)、血管新生、免疫反應(yīng)等使機體更好地適應(yīng)低氧環(huán)境[25]。有研究顯示HIF-1 信號通路在慢性阻塞性肺疾病患者中被激活，其可能是慢性阻塞性肺疾病治療的潛在靶點[26]。推測HIF-1 信號通路可能與COVID-19 患者的低氧血癥相關(guān)，射麻口服液可能通過調(diào)節(jié)HIF-1 信號通路減少缺氧對機體造成的損傷。由此可見，射麻口服液可能通過多種生物學(xué)通路，調(diào)節(jié)機體的免疫炎癥反應(yīng)、缺氧損傷、細(xì)胞凋亡等病理過程，對抗病毒感染，起到治療COVID-19 的作用。

綜上，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法初步探討了射麻口服液治療COVID-19 的作用機制，射麻口服液中的槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等活性成分可能通過作用于IL-6、TNF、MAPK8、MAPK3、MAPK1、IL-1B 等靶點，進而調(diào)節(jié)IL-17、TNF、Toll 樣受體及HIF-1 信號通路等多條通路發(fā)揮抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保護缺氧損傷等作用，治療COVID-19，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多途徑的整合調(diào)節(jié)作用。本研究為射麻口服液的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，并為進一步的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。