Ki-67 在卵巢癌中的表達差異及卵巢癌高危因素的研究

尹龍燕，李莉平，楊 靜，耿 寬，延 根

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510180；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院影像科，廣東 汕頭 515041）

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的中病死率一直居高不下。有研究［1-2］表明卵巢癌的5 年生存率約為45%，晚期患者的生存率僅為30%，這是因為卵巢癌的發(fā)病機制尚不明確，并且進展較為隱匿，部分患者確診時已是處于晚期，并往往對化療耐藥。因此，更好地理解卵巢癌的生物機制和預(yù)后是必要的，有助于開發(fā)更有效的治療方法。在這種背景下，應(yīng)用核Ki-67 來反映細胞的增殖活性具有極高的價值［3-6］。有研究［4］表明，Ki-67 高表達與多數(shù)腫瘤的分化相應(yīng)程度、是否浸潤轉(zhuǎn)移以及判斷預(yù)后情況密切相關(guān)。失活的擴散標(biāo)記PKi-67 可導(dǎo)致細胞死亡，特別是在增殖細胞中［4］。本研究探討腫瘤分布及其危險因素、細胞增殖活性指標(biāo)Ki-67 在不同病理類型卵巢癌中的病理意義、Ki-67 表達與卵巢癌侵潤關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2006—2012 年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院診斷為卵巢癌（病程=5 年）的156 例患者，術(shù)前經(jīng)超聲、多普勒血流頻譜檢測、病理切片檢查，符合WHO 關(guān)于卵巢癌的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，均采取手術(shù)治療，年齡為12～82 歲，平均（52.52±14.13）歲。按病理FIGO（2000 年）分期法分類:漿液性腫瘤（漿液性乳頭狀癌）81 例，黏液性腫瘤（黏液性乳頭狀癌）26 例，子宮內(nèi)膜樣癌16 例，透明細胞癌8 例，惡性畸胎瘤5 例，顆粒細胞瘤12 例，未分化癌3例，無性細胞瘤5 例。

1.2 主要試劑與儀器

Ki-67 抗體即用型，克隆號為K-2（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。DAB 顯色試劑盒和Maxvision 即用型二抗（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。Phy-3 型病理組織烘漂儀（常州鐘偉電子儀器廠）。OlympusBX40 顯微照相鏡（日本Olympus 公司）。

1.3 Ki-67 的免疫組織化學(xué)檢測

標(biāo)本采用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋以及切片。免疫組織化學(xué)染色首先經(jīng)高溫高壓抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，倒掉緩沖液，清水中沖洗2 次，每次5 min，再用PBS 沖洗2 次，每次5 min。將組織周圍PBS 液擦拭干凈，采用BSA 封閉液封閉，在37 ℃恒溫箱中進行30 min 的血清封閉過程。一抗室溫2 h，二抗室溫20 min，而后加入A、B、C 試劑各1 滴，顯微鏡下控制反應(yīng)時間及DAB 顯色過程，經(jīng)顯色確認(rèn)后蘇木精輕度復(fù)染。脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.4 評定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組織化學(xué)陽性染色呈細胞核內(nèi)棕黃色顆粒，根據(jù)染色程度和染色陽性細胞百分比來進行評分。Olympus 光學(xué)顯微鏡下觀察，每份切片隨機挑選5 個高倍視野（×400），按照如下判斷標(biāo)準(zhǔn)：0 級(基本不著色)，陽性細胞數(shù)約為0%～5%；Ⅰ級，陽性細胞數(shù)為6%～25%或胞漿或胞核內(nèi)稀疏的棕色顆粒，就是棕褐色不明顯；Ⅱ級，陽性細胞數(shù)為26%～50%，出現(xiàn)較多的棕黃色顆粒；Ⅲ級，陽性細胞數(shù)＞50%，顯示彌漫粗大的棕褐色顆粒。

1.5 隨訪

前5 年每3～6 個月進行隨訪1 次，之后每年1次。隨訪方式主要包括：電話詢問、信訪、門診復(fù)查。主要進行婦科雙合診及超聲檢查，全血細胞計數(shù)和生化檢查。如檢查中CA125 水平升高伴超聲檢查中發(fā)現(xiàn)異常時做相應(yīng)的臨床處置。隨訪時間為3～60個月。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS17.0 進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，2 組間參數(shù)比較采用t 檢驗；率的比較用卡方檢驗、Fisher 精確檢驗；以是否發(fā)生轉(zhuǎn)移或者局部浸潤為因變量，以患者的一般情況和臨床情況為應(yīng)變量，使用Logistic 回歸統(tǒng)計進行多因素分析；以患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或者死亡作為結(jié)局事件，采用逐步回歸法進行Cox 模型分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤分布及危險因素分析

左側(cè)腫瘤47 例 占30.1%，右側(cè)腫瘤78 例占50.0%，雙側(cè)腫瘤31 例占19.9%；局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84 例，占59.6%；多部位轉(zhuǎn)移或者浸潤多個器官36例，占25.5%；臨近腸壁浸潤42 例，占29.8%；大網(wǎng)膜浸潤62 例，占44.0%；轉(zhuǎn)移到肝臟、肺部或者遠處淋巴結(jié)7 例，占5.0%。以患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或者死亡作為結(jié)局事件，采用逐步回歸法進行Cox 模型分析，發(fā)現(xiàn)化療次數(shù)和孕次是保護因素，而局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和盆腔浸潤是危險因素，見表1。

表1 卵巢癌Cox 模型篩選的危險因素及參數(shù)估計

2.2 有無浸潤及不同病理組織分類中Ki-67 表達比較

156 例患者中85 例患者進行Ki-67 的免疫組織化學(xué)檢測。Ki-67 表達呈陰性（0 級）18 例：上皮性腫瘤11 例，生殖性腫瘤7 例；未見遠處組織或周邊組織的浸潤11 例，有浸潤7 例。Ki-67 表達呈弱陽性（Ⅰ級）21 例：上皮性腫瘤20 例，生殖性腫瘤1例；未見遠處組織或周邊組織的浸潤8 例，有浸潤13 例。Ki-67 表達呈強陽性（Ⅱ級）20 例：上皮性腫瘤19 例，生殖性腫瘤1 例；未見遠處組織或周邊組織的浸潤2 例，有浸潤18 例。Ki-67 表達呈強陽性（Ⅲ級）26 例：上皮性腫瘤24 例，生殖性腫瘤2 例；未見遠處組織或周邊組織的浸潤6 例，有浸潤20例。有無浸潤之間Ki-67 表達水平比較差異有統(tǒng)計意義（有浸潤的腫瘤組織Ki67 陽性程度比較高，P＜0.01）；不同病理組織分類之間Ki-67 表達水平比較差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。見表2—4。

表2 156 例患者Ki-67 檢測情況 %

表3 有無浸潤患者Ki-67 等級 例

表4 不同病理組織類別Ki-67 等級 例

3 討論

對卵巢癌患者全面確定病理組織類型及病理分期探查術(shù)是近年來提出的新手術(shù)觀念，目的是對惡性卵巢癌準(zhǔn)確分期，以指導(dǎo)治療方案。NCCN 指南（2011 年版）［7］指出需要行手術(shù)治療的患者，不管是根治性手術(shù)還是保守手術(shù)，都應(yīng)該仔細、全面、認(rèn)真地分期，這樣可以更全面地評價腫瘤，從而有可能降低術(shù)后復(fù)發(fā)率。Ki-67 是細胞核內(nèi)一種蛋白抗原，主要參與細胞分裂增殖相關(guān)過程，分子質(zhì)量為345 ku和395 ku，其相關(guān)基因編碼的位置處于第10 號染色體上[8］。Ki-67 出現(xiàn)于細胞有絲分裂期的G1 中期到晚期，隨著有絲分裂的進行，再S 期和G2 期逐漸達到峰值，分裂結(jié)束后，將抗原決定簇迅速降解或丟失，在G0 期時則不表達，半衰期為l h 或更短。目前研究［4，9-11］已經(jīng)表明，Ki-67與相關(guān)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有著密切關(guān)系，近年來在臨床或者腫瘤研究中得到廣泛應(yīng)用，被認(rèn)為是反映細胞增殖活性的理想指標(biāo)。Ki-67 的高表達被認(rèn)為與多數(shù)腫瘤的相關(guān)分化程度、是否浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況有關(guān)[4，12-13］；Ki-67 在卵巢良性、交界性、惡性上皮性腫瘤中，其表達水平依次提高，尤其是惡性組的表達水平顯著高于良性組及交界組[14-16］。本研究結(jié)果顯示：有無侵潤及不同病理組織分類中Ki-67 表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。Ki-67 作為一種判斷細胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，對于判斷卵巢癌發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后判斷都是極有意義的，并可以間接指導(dǎo)治療方案。

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的途徑與方式主要是血行轉(zhuǎn)移和種植性轉(zhuǎn)移。卵巢癌易發(fā)生種植播散，腫瘤多穿透盆腔形成腹膜種植，脫落的種植細胞可隨腹水種植到膈下。淋巴轉(zhuǎn)移主要累及髂內(nèi)、外淋巴結(jié)，主動脈旁及主動脈前淋巴結(jié)。腹膜種植轉(zhuǎn)移可分成兩種：浸潤性種植與非浸潤性種植。其中浸潤性種植較為典型，特點為上皮組織增生不規(guī)則，并浸潤?quán)徑蛳路降恼＝M織。對于浸潤性與非浸潤性種植的診斷標(biāo)準(zhǔn)，目前尚有爭議。Bell 等[17］提出的對浸潤性種植的診斷標(biāo)準(zhǔn)是：上皮不規(guī)則增生，浸潤腹膜鄰近或下方的正常組織，并且另外提出了2 個診斷浸潤性種植的額外附加標(biāo)準(zhǔn)：1)微乳頭結(jié)構(gòu)；2)實性上皮巢或乳頭被空隙包圍。NCCN 指南（2011 年版）針對卵巢腫瘤化療一線方案仍建議采用包括腹腔化療和紫杉醇化療在內(nèi)的4 種方案。Bell 等［18］認(rèn)為有以下危險因素：1)年齡＞55 歲；2)腫瘤包膜不完整、腫瘤破裂；3)腹水及廣泛粘連；4)組織學(xué)為非漿液性者；5)DNA 指數(shù)為非整倍體；6) CA125、血清基質(zhì)金屬蛋白酶2(MP-2)明顯增加，尿微量白蛋白(UMA)及CEA 強陽性表達者及處于進展期者，應(yīng)在術(shù)后行輔助化療。在本研究中，筆者利用逐步回歸法對Cox 模型進行分析，探討化療次數(shù)和孕次、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和盆腔浸潤等多因素作用下預(yù)后及生存率的關(guān)系。結(jié)果示化療次數(shù)和孕次是保護因素，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和盆腔浸潤是高危因素。因此，臨床工作中應(yīng)注重這些危險因素的處理與化療結(jié)合的密切關(guān)系。

Ki-67 的表達與卵巢癌病理分期密切相關(guān)，對臨床治療提供了一個全面、客觀的信息。由于卵巢癌預(yù)后多發(fā)危險因素，應(yīng)對患者進行密切隨訪。在對卵巢癌患者的診斷及治療時應(yīng)全面觀察及評價，對有高危因素者及有條件化療者應(yīng)給予化療。

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