直接免疫熒光法檢驗(yàn)狂犬病毒毒價(jià)和滅活效果試驗(yàn)

文│張傳明 蔣雯雯 楊敏 虞華芳（江蘇省常州同泰生物藥業(yè)科技有限公司）

直接免疫熒光法檢測(cè)狂犬病毒毒價(jià)比小鼠腦內(nèi)接種法約高100.17～100.50，呈平行關(guān)系，并且兩者做滅活檢驗(yàn)結(jié)果完全一致。所以，直接免疫熒光法可取代小鼠腦內(nèi)接種法做狂犬病毒毒價(jià)檢測(cè)和滅活檢驗(yàn)。

狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的人畜共患病，遍布世界各地，我國(guó)是狂犬病的高發(fā)區(qū)。自從新中國(guó)成立以來，狂犬病有三次大流行。第一次是在20世紀(jì)50年代中期。第二次大流行是從20世紀(jì)70年代末期到90年代初期，此次流行共持續(xù)了十幾年，最高年份有多達(dá)7000人死于狂犬病。到20世紀(jì)90年代中期，由于人狂犬病疫苗的改進(jìn)，發(fā)病人數(shù)逐年減少。但新世紀(jì)以來，隨著養(yǎng)犬?dāng)?shù)量的增加，狂犬病的發(fā)病人數(shù)又逐漸上升。據(jù)原衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，2006年發(fā)病人數(shù)已超過3000。預(yù)計(jì)今后有增加的趨勢(shì)。因?yàn)槿丝袢≈饕侨埖葘櫸镆怂?，所以預(yù)防狂犬病的主要環(huán)節(jié)是對(duì)犬貓進(jìn)行100%免疫預(yù)防。世界上發(fā)達(dá)國(guó)家通過免疫犬貓等寵物，已經(jīng)完全控制了寵物的狂犬病，幾十年來，再?zèng)]有報(bào)道人從寵物感染狂犬病的病例。南美各國(guó)在泛美衛(wèi)生組織的帶領(lǐng)下，從20世紀(jì)80年代末普遍開展寵物免疫活動(dòng)，經(jīng)過10多年的努力，寵物的狂犬病得到了控制，人的狂犬病病例也因此大大下降。

近年來，我國(guó)狂犬病病例急速上升，與我國(guó)養(yǎng)犬?dāng)?shù)量增加有關(guān)。據(jù)農(nóng)業(yè)部估計(jì)，國(guó)內(nèi)養(yǎng)犬?dāng)?shù)量已超過1億只。這可能還是比較保守的估計(jì)。我國(guó)90%以上的狂犬病病人是由犬傳染的。犬貓等寵物的狂犬病防治主要靠預(yù)防性接種。在20世紀(jì)50年代，狂犬病弱毒株，比如ERA、SAD、LEP等，也曾用來免疫寵物或者野生動(dòng)物，但發(fā)現(xiàn)這些弱毒活疫苗有返毒現(xiàn)象而引起疾病。所以，狂犬病病毒減毒活疫苗不再用于犬貓等寵物預(yù)防性接種。世界上其他國(guó)家目前所用的動(dòng)物狂犬病疫苗都為滅活苗，多數(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，也有腦組織培養(yǎng)的疫苗。用于生產(chǎn)狂犬病病毒滅活苗的毒株包括PV、SAD、ERA、SAD、HEP等。目前我國(guó)生產(chǎn)的動(dòng)物用狂犬病滅活疫苗的單位基本都是用小鼠腦內(nèi)接種法檢測(cè)狂犬病毒的毒價(jià)和滅活效果，但用小鼠檢驗(yàn)存在時(shí)間長(zhǎng)、成本高、結(jié)果不穩(wěn)定等較多不利因素。我們用直接免疫熒光法做了狂犬病毒毒價(jià)檢測(cè)和滅活效果檢測(cè)比較試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

一、試驗(yàn)材料與方法

1.試驗(yàn)材料。

（1）狂犬病SAD株病毒和BSR細(xì)胞均從美國(guó)Kansas State University引進(jìn)，由常州同泰生物藥業(yè)科技有限公司培養(yǎng)傳代。

（2）熒光素（FITC）標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白抗體購(gòu)于美國(guó)Fujirebio公司。

2.試驗(yàn)動(dòng)物。無特定病原體（SPF）小鼠，ICR品系，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

3.試驗(yàn)方法。

（1）用小鼠腦內(nèi)接種法檢測(cè)狂犬病毒毒價(jià)。將狂犬病毒液用磷酸鹽緩沖液（PBS）作10倍系列稀釋，取3個(gè)適宜稀釋度在11～13克的SPF小鼠腦內(nèi)注射，每只0.03毫升，觀察14日，按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）。

（2）直接免疫熒光法檢測(cè)狂犬病毒毒價(jià)。

病毒稀釋。準(zhǔn)備2塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，先在第1塊96孔板每孔中加入180微升培養(yǎng)液；在第1列孔中加入20微升待檢病毒原液，充分混勻；從第1列孔中吸出20微升加入到第2列孔中，充分混勻；依次類推，直至加到最后一列孔；從第1列孔到第8列孔稀釋度分別為10-1～10-8；每個(gè)稀釋度6孔。

加樣。取出第2塊96孔板，將第1塊96孔板中的病毒稀釋液吸至第2塊96孔板的相應(yīng)孔中，每孔100微升。

培養(yǎng)。在每孔中加入100微升含2×104BSR細(xì)胞懸液，混勻，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。

固定。棄掉96孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用pH 7.2、0.07摩爾/升的PBS洗板1次，再用80%丙酮洗板1次，然后用80%丙酮室溫固定30分鐘，棄丙酮后置于室溫干燥。

熒光染色。每孔加入50微升工作濃度的熒光素標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白抗體，輕輕搖晃后放入濕盒中37℃孵育30分鐘；棄掉熒光標(biāo)記核蛋白抗體，用PBS洗兩次；再吸掉多余的PBS。

觀察。置于熒光顯微鏡下觀察。通過熒光病灶形成的稀釋度及熒光病灶的孔數(shù)來計(jì)算病毒熒光灶單位（FFU）。

（3）用小鼠腦內(nèi)接種法做狂犬病毒滅活檢驗(yàn)。將滅活后的病毒原液在10只11～13克的SPF小鼠腦內(nèi)接種，每只0.03毫升，觀察14日；14日后撲殺所有存活小鼠，取小鼠腦組織用含2%牛血清的生理鹽水制成10%的勻漿，混合離心，取上清，再次腦內(nèi)接種11～13克的SPF小鼠10只，每只0.03毫升，觀察14日。接種后4日內(nèi)死亡的小鼠屬非特異性死亡，不計(jì)算在內(nèi)；每組4日內(nèi)死亡數(shù)應(yīng)不超過1只。

（4）用直接免疫熒光法做狂犬病毒滅活檢驗(yàn)。取滅活病毒液，10倍稀釋后接種于已長(zhǎng)成良好單層的BSR細(xì)胞，每個(gè)樣品接種4只T25瓶，置33～35℃孵育1小時(shí)后棄去接種液，加病毒維持液5毫升繼續(xù)培養(yǎng)7日，同時(shí)設(shè)未接種的BSR細(xì)胞做空白對(duì)照。7日后盲傳1代，再繼續(xù)培養(yǎng)7日。棄掉細(xì)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，再用80%丙酮洗滌一次，然后用80%丙酮室溫固定30分鐘，棄丙酮后置于室溫干燥；每瓶加入1毫升工作濃度的熒光素標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白抗體，37℃孵育30分鐘；棄掉熒光標(biāo)記核蛋白抗體，用PBS洗2次，晾干后在熒光顯微鏡下觀察。

二、結(jié)果

1.狂犬病毒毒價(jià)檢測(cè)。我們做了10批狂犬病毒的毒價(jià)檢測(cè)比較試驗(yàn)，分別用小鼠腦內(nèi)接種法和直接免疫熒光法（細(xì)胞）檢測(cè)病毒毒價(jià)，結(jié)果見表1。

從表1可以看，用兩種方法檢測(cè)狂犬病毒毒價(jià)的平行關(guān)系非常好，直接免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果比小鼠腦內(nèi)接種法約高100.17～100.50。

2.狂犬病毒滅活效果檢測(cè)。我們將上述10批病毒液滅活后，分別用小鼠腦內(nèi)接種法和直接免疫熒光法檢測(cè)滅活效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法做出的滅活檢驗(yàn)結(jié)果完全一致。

三、討論

1.小鼠腦內(nèi)接種法的缺點(diǎn)。

（1）結(jié)果受試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體影響較大。不同批次的小鼠個(gè)體差異較大，有時(shí)小鼠較為敏感，死亡率偏高，有時(shí)死亡率又會(huì)偏低，因此同樣一個(gè)病毒樣品，不同時(shí)間檢測(cè)、不同人員檢測(cè)，或用不同批次的小鼠檢測(cè)，都會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果，造成該試驗(yàn)的重復(fù)性不高。

表1 狂犬病毒毒價(jià)檢測(cè)結(jié)果

（2）由于需要對(duì)小鼠進(jìn)行腦內(nèi)注射病毒液，對(duì)試驗(yàn)人員的操作技能要求較高，對(duì)小鼠的注射部位、接種量要非常準(zhǔn)確，接種部位稍有偏差，劑量稍有變化都會(huì)影響毒價(jià)檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)常造成一些小鼠因接種操作而造成非特異性死亡。

（3）檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，滅活檢驗(yàn)每次接種小鼠后需觀察14天，兩次接種至少需要28天；毒價(jià)檢測(cè)至少需14天。

（4）檢測(cè)成本高，每個(gè)滅活樣品至少需要20只SPF小鼠，每個(gè)毒價(jià)檢測(cè)樣品至少需要15只SPF小鼠，飼養(yǎng)成本和試驗(yàn)動(dòng)物房資源占用成本很高。

2.直接免疫熒光法的優(yōu)點(diǎn)。

（1）操作方便。細(xì)胞培養(yǎng)和接種操作非常簡(jiǎn)便，比接種小鼠腦腔相對(duì)容易掌握，不會(huì)造成動(dòng)物非特異死亡所帶來的結(jié)果偏差，只需控制好細(xì)胞無菌培養(yǎng)即可。

（2）結(jié)果客觀可靠。細(xì)胞培養(yǎng)條件相對(duì)比較好控制，不存在試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異因素，不同批次的細(xì)胞均來源于同一株種細(xì)胞，因此不同時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞差異不大，只要控制好細(xì)胞的接種數(shù)，每次檢測(cè)的結(jié)果相對(duì)比較穩(wěn)定，因此重復(fù)性比較好。

（3）檢測(cè)時(shí)間短。病毒毒價(jià)檢測(cè)僅需48小時(shí)，為小鼠腦內(nèi)接種法的1/7；滅活檢驗(yàn)最多需14天，比小鼠腦內(nèi)接種法縮短一半時(shí)間。

（4）檢測(cè)成本低。每個(gè)病毒樣品或滅活樣品僅需一些BSR細(xì)胞和熒光抗體，僅為小鼠腦內(nèi)接種方法成本的1/4左右。

綜合以上兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，用直接免疫熒光方法檢測(cè)狂犬病毒的毒價(jià)和滅活效果取代小鼠腦內(nèi)接種法是完全切實(shí)可行的。