傳統(tǒng)中草藥高通量測(cè)序技術(shù)RNA－seq及l(fā)ncRNA挖掘的應(yīng)用策略

白晶，李力恒，孫堯，扈韻綺，付博

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2．黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，東北林業(yè)大學(xué)博士后科研流動(dòng)站，黑龍江 哈爾濱 150086;3．黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

中藥成分的藥理學(xué)及化學(xué)研究已很成熟，但其天然活性成分的調(diào)控機(jī)理、生物合成途徑的研究才剛起步。未來(lái)中醫(yī)藥發(fā)展的主要方向，是運(yùn)用次生代謝工程手段研發(fā)生產(chǎn)中藥，對(duì)于中草藥次生代謝產(chǎn)物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制的闡明尤為重要。

然而，由于大多數(shù)中草藥為非模式生物，很多中草藥的生長(zhǎng)、發(fā)育、次生代謝等生物學(xué)過(guò)程中的分子機(jī)制尚未得到詳細(xì)闡述，大多數(shù)藥用植物基因組信息缺乏，遺傳信息和功能基因的研究滯后，尤其是對(duì)以上過(guò)程中的功能基因挖掘明顯滯后于模式植物，這嚴(yán)重阻礙了傳統(tǒng)中醫(yī)向現(xiàn)代中醫(yī)的發(fā)展。因此，對(duì)傳統(tǒng)中草藥重要功能基因的挖掘成為當(dāng)務(wù)之急。

轉(zhuǎn)錄組代表細(xì)胞或組織內(nèi)全部RNA轉(zhuǎn)錄本，包括編碼蛋白質(zhì)的mRNA和各種非編碼RNA(microRNA、lncRNA等)。后基因組時(shí)代，轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，對(duì)解決生物學(xué)功能研究、基因進(jìn)化、遺傳育種以及生態(tài)多樣性等諸多方面的問(wèn)題具有重要意義，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床診斷和藥物研發(fā)［1］。藥用植物次生代謝產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵酶基因的發(fā)現(xiàn)，次生代謝途徑的闡明，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示了重要的應(yīng)用價(jià)值。RNA－seq作為新興的高通量測(cè)序技術(shù)以其成本低，速度快，精確度高等優(yōu)勢(shì)逐漸應(yīng)用到轉(zhuǎn)錄組的研究中［2－3］。近期，作為非編碼RNA的lncRNA逐漸得到了研究人員的重視，并認(rèn)為lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，廣泛參與生理活動(dòng)和疾病過(guò)程［4］。

應(yīng)用RNA－seq技術(shù)挖掘傳統(tǒng)中草藥中若干重要長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)可為闡明中草藥的生長(zhǎng)、發(fā)育、次生代謝等生物學(xué)過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。本文將對(duì)中草藥RNA－seq技術(shù)研究策略及l(fā)ncRNA挖掘方法做簡(jiǎn)要綜述。

1 RNA－seq技術(shù)用于中草藥轉(zhuǎn)錄組研究的優(yōu)勢(shì)

通過(guò)單基因研究策略不能很快揭示中草藥天然活性成分生物合成途徑，亟需采用高通量方式在整體水平上全面分析基因組和功能表達(dá)之間的聯(lián)系。因此，從RNA水平研究中草藥在特定生長(zhǎng)時(shí)期和培養(yǎng)條件下全基因組轉(zhuǎn)錄情況可揭示基因編碼RNA(mRNA)和非編碼RNA(Non－codingRNA，ncRNA)的表達(dá)水平及其調(diào)控規(guī)律，進(jìn)一步推動(dòng)中草藥基因功能和ncRNA調(diào)控機(jī)制的研究。上一代轉(zhuǎn)錄組研究方法主要通過(guò)基因芯片技術(shù)、基于傳統(tǒng)sanger測(cè)序法的SAGE技術(shù)(serial analysis of gene expression)、LongSAGE技術(shù)、MPSS(massively parallel signature sequencing)等。其中，基因芯片技術(shù)應(yīng)用較廣。但與RNA－seq研究方法相比，基因芯片技術(shù)存在以下缺陷:

1)基因芯片的精確度依賴于探針的數(shù)量和重疊度，使得基因芯片的成本大大增加。

2)由于基因芯片是通過(guò)判斷雜交信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)間接反映轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平，因此容易受到背景信號(hào)和交錯(cuò)雜交的干擾，也不能用于低豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)(細(xì)胞內(nèi)低豐度的ncRNA往往具有重要的調(diào)控作用并發(fā)揮重要生物學(xué)功能)。

3)基因芯片法必須有相應(yīng)物種的基因組序列作參照［5］。

因此該方法只能用于基因組序列已知的物種的轉(zhuǎn)錄組分析，使得缺乏基因組序列參照的傳統(tǒng)中草藥轉(zhuǎn)錄組研究舉步維艱。

RNA－seq測(cè)序剛剛發(fā)展起來(lái)，它利用深度測(cè)序方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，該技術(shù)正在改變著轉(zhuǎn)錄組研究的方式，它具有以下優(yōu)勢(shì):

1)在轉(zhuǎn)錄組水平上發(fā)現(xiàn)SNP。識(shí)別一個(gè)基因不同的轉(zhuǎn)錄本和可變剪切位點(diǎn)。

2)無(wú)需設(shè)計(jì)特異性的探針。可以無(wú)研究物種基因信息，直接對(duì)任何物種的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。

3)以更高的分辨率和覆蓋度對(duì)細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行直接檢測(cè)。

4)能夠檢測(cè)未知基因和發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。

5)測(cè)序成本大大降低。

目前，有Illumina公司(Genome Analyzer II)、ABI公司(ABSOLiD)、Roche公司(454 GS－FLX)三大公司是比較大規(guī)模平行測(cè)序(Massive parallel sequencing，MPS)的技術(shù)平臺(tái)。這三個(gè)平臺(tái)各有優(yōu)勢(shì)，其中，Illumina公司的Genome Analyzer II平臺(tái)通過(guò)文庫(kù)構(gòu)建、錨定橋接、PCR擴(kuò)增、單堿基延伸測(cè)序等步驟實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)序過(guò)程，該平臺(tái)具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)，是目前使用最廣泛的新一代測(cè)序平臺(tái)。ABI公司的ABSOLiD平臺(tái)具有讀取精確度高和數(shù)據(jù)輸出量大和低成本等優(yōu)勢(shì)，但序列讀長(zhǎng)較短，測(cè)序后數(shù)據(jù)的裝配需要強(qiáng)大生物信息學(xué)分析技術(shù)的支持。Roche公司的454 GS－FLX平臺(tái)雖準(zhǔn)確率較低，成本高，但讀長(zhǎng)可達(dá)400bp，尤其適用于缺乏基因組參考而需要從頭拼接的中草藥等轉(zhuǎn)錄組研究。

筆者認(rèn)為，在中草藥大多缺乏可參考的基因組信息的情況下，Roche公司的454 GS－FLX平臺(tái)比較適合中草藥的RNA－seq研究。因?yàn)?，測(cè)序讀長(zhǎng)越長(zhǎng)，越有利于序列的組裝和生物信息學(xué)分析，Roche公司的454 GS－FLX平臺(tái)可達(dá)400bp左右。

目前，應(yīng)用RNA－seq技術(shù)，可以對(duì)中草藥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)及變異、基因表達(dá)水平差異、非編碼區(qū)域功能、低豐度全新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)等研究。RNA－seq已經(jīng)成功用于水稻、玉米等的大規(guī)模EST測(cè)序研究，并發(fā)現(xiàn)了這些物種更多 EST［6－8］。例如，Logacheva等通過(guò)比較甜蕎(F．esculentum)和苦蕎(F．tataricum)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，分析了兩者的差異表達(dá)基因，這些差異基因包括逆轉(zhuǎn)座子基因以及糖類合成與代謝相關(guān)基因［9］。

最近，我國(guó)學(xué)者對(duì)少數(shù)中草藥的轉(zhuǎn)錄組研究上也取得了可喜進(jìn)展［10－12］。

盡管RNA－seq技術(shù)的應(yīng)用前景廣闊，但該技術(shù)也面臨一系列挑戰(zhàn)，在海量的序列數(shù)據(jù)中，如何詮釋和鑒定同源基因，如何確定最佳測(cè)序深度，如何針對(duì)更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組來(lái)識(shí)別RNA亞型的表達(dá)變化，如何降低樣本起始量以滿足某些珍貴中草藥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求，如何提供序列轉(zhuǎn)錄的方向信息，以及在缺乏基因組信息的情況下，如何對(duì)中草藥等非模式生物測(cè)序序列進(jìn)行基因組定位和注釋(目前，只能進(jìn)行從頭拼裝，并通過(guò)同源比對(duì)進(jìn)行測(cè)序序列的注釋和分析，因此對(duì)后期生物信息學(xué)分析方法及軟件有極高的要求)。相信隨著測(cè)序方法的不斷進(jìn)步，使用更長(zhǎng)的讀段技術(shù)或單分子測(cè)序技術(shù)有望回答以上問(wèn)題。

2 lncRNA生物信息學(xué)挖掘方法

非編碼RNA是一類不編碼蛋白質(zhì)但具有多種重要生物學(xué)調(diào)控功能的RNA分子，可以通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性及參與RNA的加工和修飾、參與蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、調(diào)控染色體的結(jié)構(gòu)等機(jī)制，發(fā)揮在胚胎發(fā)育、組織分化、器官形成等生物學(xué)過(guò)程中的調(diào)控作用。

近期，非編碼 RNA中的長(zhǎng)非編碼 RNA(long non－protein coding RNA，lncRNA)得到了研究人員的廣泛關(guān)注。長(zhǎng)非編碼RNA是在真核生物中新發(fā)現(xiàn)的一類核苷酸，它具有低豐度、類似mRNA結(jié)構(gòu)特征，無(wú)長(zhǎng)閱讀框架，且長(zhǎng)度大于200 bp?；虮磉_(dá)、基因組印記、表觀遺傳調(diào)控、X染色體失活、蛋白質(zhì)折疊等生物學(xué)過(guò)程，都有其廣泛參與。

lncRNA還可以作為分子伴侶調(diào)控蛋白質(zhì)的構(gòu)象和作為結(jié)構(gòu)分子錨定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的位置。不僅可以通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子來(lái)激活或抑制靶基因的表達(dá)，還能參與組蛋白修飾、mRNA拼接等過(guò)程。

雖然lncRNA在各種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用，而且目前部分lncRNA已得到確定，但對(duì)絕大部分lncRNA在生命活動(dòng)過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制及功能模式仍不清楚，中草藥轉(zhuǎn)錄組中l(wèi)ncRNA資源更是急待挖掘。

現(xiàn)階段lncRNA的預(yù)測(cè)仍依賴生物信息學(xué)技術(shù)，以挖掘其中l(wèi)ncRNA的序列、結(jié)構(gòu)、表達(dá)及功能等信息。使用生物信息學(xué)方法對(duì)RNA－seq測(cè)序結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行RNAi和RIP等lncRNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，可以避免功能研究實(shí)驗(yàn)的盲目性，從而節(jié)約大量實(shí)驗(yàn)成本。

將測(cè)序讀段集合并恢復(fù)轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)的過(guò)程被稱作轉(zhuǎn)錄組重建，轉(zhuǎn)錄組重建主要分為參考基因組法和基因組獨(dú)立法，基因組獨(dú)立法更適用于中草藥轉(zhuǎn)錄組重建，同時(shí)需要較高的測(cè)序深度。轉(zhuǎn)錄組重建后通過(guò)Cuffcompare等軟件將重建轉(zhuǎn)錄組與現(xiàn)有基因注釋進(jìn)行比較，以獲取重建轉(zhuǎn)錄組的分類，進(jìn)而利于lncRNA的識(shí)別過(guò)程。lncRNA識(shí)別過(guò)程簡(jiǎn)要概述如圖1。

圖1 IncRNA識(shí)別過(guò)程

提取外顯子總長(zhǎng)度大于200堿基的轉(zhuǎn)錄本，此閾值是由lncRNA的定義所決定，本質(zhì)上是用來(lái)區(qū)分lncRNA與小ncRNA(如miRNA等)，但從轉(zhuǎn)錄本中區(qū)分mRNA與ncRNA確實(shí)是一個(gè)繁瑣復(fù)雜的過(guò)程。對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的mRNA來(lái)說(shuō)，其開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度一般大于300堿基，若RNA序列的假定ORF長(zhǎng)度小于300堿基，則會(huì)被判定為ncRNA，但這顯然會(huì)導(dǎo)致H19、Xist等假定ORF長(zhǎng)度大于300堿基的ncRNA的誤判。應(yīng)用CPC、CONC、lncRNA等監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)(supervised machine learning)方法，可通過(guò)學(xué)習(xí)肽鏈長(zhǎng)度、氨基酸構(gòu)成、蛋白質(zhì)同源性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)比對(duì)或表達(dá)等多種特征，建立分類模型，因而可以減少此類誤判的發(fā)生。

近年來(lái)，研究人員開發(fā)了多種用于lncRNA差異表達(dá)分析的軟件。其中，EdgeR、Cuffdiff、DESeq和DEXSeq等方法引入負(fù)二項(xiàng)分布(negative bionormial distribution)模型，相比泊松分布能更好地適應(yīng)生物學(xué)偏差。隨著生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，研究人員也開發(fā)了包括catRAPID(Fast predictions of RNA and protein interactions and domains)在內(nèi)的若干在線分析lncRNA的生物信息學(xué)平臺(tái)。但是，比較綜合且較完善的涵蓋各物種lncRNA的強(qiáng)大數(shù)據(jù)庫(kù)尚未建立，由于lncRNA屬于低豐度mRNA，需要RNA－seq的測(cè)序深度更深，中草藥重要功能lncRNA的挖掘面對(duì)極大的挑戰(zhàn)。

當(dāng)前，lncRNA研究正處于起步階段，面臨著諸多問(wèn)題亟待解決:

1)lncRNA的定義尚存爭(zhēng)議。一般認(rèn)為，lncRNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。但是，有研究者認(rèn)為，以200個(gè)核苷酸作為界定lncRNA過(guò)于武斷，因?yàn)楹芏嘈∮?00個(gè)核苷酸的非編碼RNA既不屬于小RNA(Small RNA)也不屬于結(jié)構(gòu)RNA(Structural RNA)。

2)如何區(qū)分功能性和非功能性非編碼轉(zhuǎn)錄物依然存在困難。

3)由于lncRNA種類和功能的多樣性，致使不同lncRNA研究結(jié)果之間的借鑒意義不高。

4)已有l(wèi)ncRNA數(shù)據(jù)較少，對(duì)lncRNA的注釋不夠豐富。

3 結(jié)語(yǔ)

盡管RNA－Seq技術(shù)還面臨著種種困難，而且，目前對(duì)lncRNA的生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)特征知之甚少，但是它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的轉(zhuǎn)錄本的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)，相信隨著生物物理技術(shù)的不斷進(jìn)步和測(cè)序成本的進(jìn)一步降低，通過(guò)RNA－Seq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)中草藥中l(wèi)ncRNA的序列、結(jié)構(gòu)、表達(dá)及功能等信息的挖掘，定會(huì)為中草藥的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝等生物學(xué)過(guò)程中的分子機(jī)制的闡明奠定理論基礎(chǔ)。

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