牡蠣蛋白分離組分的酶法改性*

張晶晶，鄭惠娜，章超樺，郝記明，張靜，范朝泳

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江，524088)

牡蠣屬軟體動物門，雙殼綱，珍珠貝目，牡蠣科，俗稱蠔，別名蠣黃、蠔白、海蠣子。牡蠣是一種珍貴的海產(chǎn)軟體動物，它不僅是一種著名的海產(chǎn)貝類，而且是一種天然保健食品。我國每年牡蠣產(chǎn)量居全球首位，2012年牡蠣產(chǎn)量達394.88×104t，占貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量的 32.68%［1］。

蛋白質(zhì)會對食品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和加工性狀產(chǎn)生重大影響，這主要是因為蛋白質(zhì)具有不同的功能性質(zhì)。首先判斷蛋白質(zhì)是否具有潛在應(yīng)用價值的一個指標就是蛋白質(zhì)的溶解性，起始溶解性較大的蛋白質(zhì)，有利于蛋白質(zhì)其他功能性質(zhì)的提高。水產(chǎn)蛋白的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性較低，容易變性，在牡蠣蛋白提取過程中也有不同程度的變性，其中冷凍干燥的影響最大，導(dǎo)致其溶解性和乳化性不佳，不能完全滿足食品加工的需求，所以在食品加工中的應(yīng)用受到限制。因此，對牡蠣蛋白進行改性，提高牡蠣蛋白制品營養(yǎng)成分的生物有效、利用性成為食品加工業(yè)亟待解決的問題。

酶法改性是一種常用的改性方法，可以得到功能特性優(yōu)良的蛋白［2］。酶水解程度不同導(dǎo)致牡蠣蛋白結(jié)構(gòu)等方面的改變也不同，通過酶改性可得到滿足不同需求的功能性牡蠣蛋白質(zhì)，從而拓寬牡蠣蛋白在食品工業(yè)中應(yīng)用的范圍［3］。目前，國內(nèi)外學(xué)者在蛋白的改性研究方面做了許多工作［4-5］。Adler-Nissen和Olsen［6］研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白經(jīng)堿性蛋白酶和中性蛋白酶有限酶解后，溶解性和乳化性都有很大的提高。Qi Hettiarachchy 和 Kalapathy［7］同樣證明酶法改性的效果，研究證明適當(dāng)?shù)拿附獾鞍卓梢蕴岣叩鞍椎娜芙庑?、乳化性、乳化穩(wěn)定性和起泡能力。然而，有關(guān)酶法改性的研究大多數(shù)是以魚蛋白為對象，而對貝類的酶法改性研究，報道較少。

本研究在前期對牡蠣蛋白進行分離并研究其功能特性中發(fā)現(xiàn)，水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的溶解性和乳化性均不佳，故分別使用了胰蛋白酶和堿性蛋白酶對3種牡蠣蛋白分離組分進行水解，并對牡蠣蛋白各個時間段的酶解產(chǎn)物的溶解性和乳化性的變化趨勢進行了比較，獲取具有更佳功能特性的蛋白，為進一步利用牡蠣蛋白提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試劑材料

胰蛋白酶(trypsin)，活力單位25萬 U/g，購于Simga公司;堿性蛋白酶(Alcalase)Alcalase 2.4 L，活力單位20萬U/g，購于諾維信公司。金龍魚特香花生油為食品級，益海嘉里食品營銷有限公司產(chǎn)品。試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

PHS-25數(shù)顯pH計，上?？祪x儀器有限公司;BL-6205精密電子天平，上海市島津制作所;CR22G高速冷凍離心機，日本Hitachi公司;TJ12-A絞肉機，廣東番禹恒聯(lián)食品機械廠;T25高剪切乳化分散機德國IKA;UV-2102PC紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牡蠣蛋白的制備

牡蠣蛋白組分的制備參考文獻［8］的制備方法。

1.3.2 酶法改性

配制質(zhì)量濃度為5%的蛋白溶液，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0，分別加入胰蛋白酶和堿性蛋白酶(加酶量 E/S=1∶200)分別反應(yīng) 10、20、30、40、50、70、110、150、200 min，采用甲醛滴定法測定水解度。反應(yīng)結(jié)束后，100℃滅酶10 min，冷卻后離心(4℃，5 000 r/min，15 min)，取上清液調(diào) pH至7.0。對照樣在不加酶的情況下同上操作。

1.3.3 水解度的測定［6］

吸取5 mL樣液，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20 mL，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，開動磁力攪拌器，用0.05 mol/L NaOH滴定至酸度計顯示pH=8.2，記下消耗的NaOH體積，加入10 mL甲醛混勻，再用NaOH繼續(xù)滴定至pH=9.2，記下消耗的NaOH體積:

式中:X4為樣品中氨基態(tài)氮含量(以氮計)，g/100 mL;V4為滴定樣品稀釋液消耗0.05 mol/L NaOH標準滴定溶液的體積，mL;V3為空白試驗消耗0.05 mol/L NaOH標準滴定溶液的體積，mL;V5為樣品稀釋液用來，mL;C3為NaOH標準滴定溶液濃度，mol/L;0.014為1.00 mL NaOH標準滴定溶液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g。

1.3.4 溶解性的測定［9］

考馬斯亮藍法測定上清液蛋白質(zhì)含量

1.3.5 乳化性的測定［10］

取蛋白濃度為0.5%(w/v)的蛋白液9 mL于25 mL量杯中，加入3 mL花生油，分別調(diào)節(jié)pH值為7，均質(zhì)1 min(固定一個位置，轉(zhuǎn)速約12 000 r/min)。迅速從量杯底部取20 μL清液加入到5 mL 0.1%(w/v)的SDS溶液中，搖勻，立即在500 nm波長下比色(以0.1%SDS為空白)測定0 min的吸光值(A0)，放置10 min后再取樣同上檢測吸光值(Al)。以A1表示乳化活力指數(shù)(EAI)，乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)表示為:

式中:D為稀釋倍數(shù)，D=250;C為蛋白質(zhì)濃度，g/mL;Φ為油相所占的比例，Φ=1/4;L為比色皿的厚度，L=1 cm;△t=10 min。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel作圖，實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行多重比較分析，結(jié)果用不同字母表示顯著性差異(P＜0.05)，數(shù)據(jù)均為3次數(shù)值的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 胰蛋白酶水解3種蛋白組分的水解情況比較

按照1.4.2的方法，用胰蛋白酶對水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白進行可控酶解，酶解過程中水解度隨時間變化如圖1所示。

圖1 胰蛋白酶水解牡蠣水溶性、鹽溶性和不溶性蛋白的水解度比較結(jié)果Fig.1 The degree of hydrolysis of oyster water-soluble，salt soluble and insoluble protein hydrolysated by trypsin(不同字母表示具有顯著性差異(P＜0.05))

反應(yīng)起始階段，底物濃度大，肽鏈的斷裂速度較快，在前70 min內(nèi)水解速度較快，之后水解度仍在增大但增加的速度趨于平緩，比較而言，水溶性蛋白最容易被水解，其次是鹽溶性蛋白和不溶性蛋白。反應(yīng)進行200 min后，胰蛋白酶水解水溶性蛋白的產(chǎn)物的水解度可達15.69%。胰蛋白酶是屬于絲氨酸蛋白酶中的一種，切開肽鍵羧基端的精氨酸和賴氨酸，肽鏈長度適中。這主要是因為隨著水解的進行，分子變小，每個分子中酶可作用的位點減少，因而酶將分子切斷成更小的分子的速度變慢。水解度越高就表示肽鍵被切斷的數(shù)目越多，越多的游離氨基酸和小肽的生成。但是水解度過高時，暴露了肽鏈中的疏水性氨基酸而產(chǎn)生苦味肽，影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)［11］。水溶性蛋白由于其本身易溶于水的性質(zhì)，分子量較小，肽鏈較短，在短時間內(nèi)蛋白酶就能達到很好的剪切效果。鹽溶性蛋白主要是肌原纖維蛋白，而胰蛋白酶對肌原纖維蛋白有較好的水解能力。任嬌艷［12］用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、Neutrase1.5 MG、Alcalase2.4L和PTN6.0分別水解羅非魚的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，發(fā)現(xiàn)相同蛋白酶作用于肌原纖維蛋白所得酶解產(chǎn)物的水解度略低于肌漿蛋白酶解產(chǎn)物，這也與肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)特點有關(guān)。這與牡蠣水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的結(jié)果相似。不溶性蛋白的主要成分是基質(zhì)蛋白，由于基質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，不溶性蛋白相對難以被水解。隨著水解時間的延長，水解度一直增加，在反應(yīng)200 min后最高達到10.93%。

2.2 堿性蛋白酶水解3種蛋白組分的水解情況比較

按照1.4.2的方法，水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解的水解情況如圖2所示。

圖2 堿性蛋白酶水解牡蠣水溶性、鹽溶性和不溶性蛋白的水解度比較結(jié)果Fig.2 The degree ofhydrolysis of oyster water-soluble，salt soluble and insoluble protein hydrolysated by alcalase(不同字母表示具有顯著性差異(P＜0.05))

堿性蛋白酶對3種蛋白的酶解情況與胰蛋白酶的水解度的變化趨勢基本相似。蛋白酶對蛋白的不同水解特性主要與其專一性有關(guān)。堿性蛋白酶是一種非特異性肽鍵內(nèi)切酶，主要作用于含疏水性羥基的肽鍵，釋放的肽鏈更短，產(chǎn)率高。由圖1和2的對比，發(fā)現(xiàn)3種樣品在相同酶解時間下，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度都比胰蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度高，反應(yīng)200 min堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度最高可達16.56%。施雪［13］用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶在最適條件下對鯉魚肉蛋白分別進行酶解，結(jié)果表明在所有的水解樣品中，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度最高。同時在水解初期水解度都很低，同樣由于堿性蛋白酶的強水解蛋白的能力，相對應(yīng)堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度高于胰蛋白酶的。任增超［14］用六種蛋白酶對羅非魚下腳料蛋白酶解后，也發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的水解效率最高。

2.3 酶法改性對溶解性的影響

圖3所示為不同水解度下水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白的堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解產(chǎn)物溶解性的變化。由圖3可知，2種蛋白酶酶解產(chǎn)物隨水解度的變化趨勢基本相似。隨著水解度的增加，水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性也增加，其后隨著時間的延長呈緩慢的增加趨勢，且均高于牡蠣各蛋白組分本身的溶解性。比較而言，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的溶解性較好。可能由于酶法水解后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞進而疏水基團暴露，分子量減小，親水性增加，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了有利于提高溶解性的變化［15］。正如 Gbogouri GA 等［16］用 Alcalase(R)蛋白酶水解三文魚的研究結(jié)果，都表明水解度越高。溶解性越好。王素雅［17］等同樣發(fā)現(xiàn)水解菜籽蛋白后，隨著水解度的增加，溶解性也增加。

在pH7.0時，水溶性蛋白的溶解性由原來的48.50%提高到82.71%，提高了1.7倍，水解度在達到8%之前，溶解性變化較小。鹽溶性蛋白的溶解性提高了2.3倍，最高達91.04%，水解度3%前溶解性變化較小，隨后急劇增加。由此看出酶解作用對鹽溶性蛋白的溶解性的提高顯著強于水溶性蛋白。不溶性蛋白由于其溶解性質(zhì)，幾乎不溶解，但是經(jīng)過兩種酶水解后，結(jié)果表明，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的水解產(chǎn)物分別最高為46.71%和46.25%，水解度3%時，溶解性變化不大，之后溶解性呈平緩的增加趨勢，較不溶性蛋白的溶解性質(zhì)，有很明顯的改善。Quaglia［18］研究比較沙丁魚的水解產(chǎn)物與本身蛋白的溶解性，也表明酶解能顯著提高溶解性。大麻分離蛋白經(jīng)酶解后，發(fā)現(xiàn)水解度在2.3% ～6.7%顯著提高蛋白的溶解性［19］，這與牡蠣鹽溶性蛋白和不溶性蛋白在水解度3%后溶解性提高的結(jié)果相近，但與小麥蛋白酶解產(chǎn)物不同［20］。

2.4 酶法改性對乳化性的影響

由圖4總體來看，牡蠣3種蛋白胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性是呈先升高后降低的趨勢。隨著水解度的增大，對維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的氫鍵、范德華力、離子鍵等鍵破壞程度也越來越大，包裹在油滴表面的肽段越來越小，使油滴表面的保護層越來越薄，最終導(dǎo)致了乳化性的降低，也導(dǎo)致了乳化穩(wěn)定性的降低［16］。

圖3 牡蠣水溶性、鹽溶性和不溶性蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性Fig.3 The solubility of oyster water-soluble，salt soluble and insoluble protein hydrolysates by different proteases

圖4 牡蠣水溶性、鹽溶性和不溶性蛋白酶解產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.4 The EAI and ESI of oyster water-soluble，salt soluble and insoluble protein hydrolysates by different proteases

水溶性蛋白胰蛋白酶和堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物在反應(yīng)50 min時，此時水解度為7.0%和7.2%時，乳化活性達到最高分別為86.63 m2/g、87.11 m2/g，乳化活力提高了1.8倍，乳化性明顯好于羅非魚下腳料，隨著水解度增加，酶解產(chǎn)物的乳化性低于原料本身。水解產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性大多數(shù)低于水溶性蛋白本身的乳化穩(wěn)定性，但乳化穩(wěn)定性高于大豆分離蛋白。堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物的水解度較高于胰蛋白酶的，而胰蛋白酶的水解產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性較好。鹽溶性蛋白胰蛋白酶和堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物在水解度為4.4%和5.8%時，乳化活性達到最高，相比原料本身的乳化活力，提高了1.8倍，乳化穩(wěn)定性提高了2.4倍，水解產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性一直高于鹽溶性蛋白本身。不溶性蛋白的胰蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物分別在水解度5.7%和6.4%時，乳化活力和乳化穩(wěn)定性均達到最高，且胰蛋白酶酶解后的乳化性較好，堿性蛋白酶的乳化穩(wěn)定性較好。Sathivel等［21］對紅鮭魚進行酶解實驗，研究表明酶解程度加深，溶解性增加，水解度在一定程度上，產(chǎn)物的乳化性最好。楊東等［22］研究鰱魚水解蛋白同樣表明一定程度的酶解提高乳化性，水解度增加反而降低乳化性。Chabanon等［23］報道從油菜籽蛋白中分離出的白蛋白和球蛋白經(jīng)有限的水解處理后，乳化活力增加，當(dāng)水解度過高時乳液的穩(wěn)定性降低。同樣Taha［24］發(fā)現(xiàn)油料子蛋白酶解處理后水解度與溶解性有直接的關(guān)系，低水解度的水解后乳化性有所提高。牡蠣蛋白經(jīng)水解后的乳化性和乳化穩(wěn)定性變化情況與這些研究結(jié)果相似，也充分證明了有限的水解能改善乳化性，這可能歸因于疏水蛋白質(zhì)的暴露提高吸附力從而形成一個有凝聚力的界面膜，加強疏水殘基與油滴、水的交互作用［25］。

3 結(jié)論

牡蠣水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白隨胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解的進行，溶解性呈上升趨勢，水解時間越長(DH越大)，溶解性越好。蛋白酶水解對乳化性的影響與分子大小密功相關(guān)，適當(dāng)水解度可以提高乳化活力，但水解度過大，對乳化活力起反作用，堿性蛋白酶水解物的水解度較高，對蛋白乳化性的反作用更大些影響。水溶性蛋白在水解度7%左右時(反應(yīng)時間50 min)乳化活力和乳化穩(wěn)定性較好;鹽溶性蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后水解度在4.4%時乳化活力較高，經(jīng)堿性蛋白酶酶解后水解度5.8%時乳化活力高;不溶性蛋白在水解度6%附近時(反應(yīng)時間60 min)有較強的乳化活力。

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