超微天麻（Gastrodia elata Bl.）粉的吸收及改善睡眠功能的研究

李武，傅莉華，鄺穎詩，盧倩，楊瑞麗

（廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）

天麻（Gastrodia elata Bl.）是蘭科天麻屬多年生草本植物天麻的干燥根莖，主產(chǎn)于我國云南、四川及貴州等地，是一種重要的藥食兩用植物。研究表明天麻的主要有效成分為天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛等多種成分[1]，天麻具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗炎等生物學功能[2-3]。隨著社會的發(fā)展，人們工作生活的壓力越來越大，隨之產(chǎn)生的焦慮、失眠等癥狀不斷困擾著人們的正常生活[4-5]。在民間，作為一種重要的食材，自古就有將天麻與雞、魚等一同食用用于滋養(yǎng)安神的做法。傳統(tǒng)的天麻加工方法是采用將鮮天麻煮或蒸后再烘干，然后切片。這種傳統(tǒng)的加工方法有容易損失有效成分、有效成分不易浸出、質(zhì)量指標難以控制等缺點，從目前的加工和食用方法來看，天麻的生物利用率還不高。超微粉碎技術是一門新興的物料加工技術，該技術在天然食物資源開發(fā)中的應用是食品加工業(yè)的一種新嘗試。超微粉碎技術在制粉技術中具有很大的優(yōu)勢，不僅在宏觀上減小顆粒粒徑，而且隨著粒徑細化的量變，會導致比表面積和孔隙率增加，使粉體具有良好的分散性和吸附性等，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[6-7]。因此，本實驗旨在研究天麻超微粉在體內(nèi)的吸收情況及對于改善睡眠作用的影響，為天麻微粉的制劑開發(fā)與應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物 健康雄性SD大鼠，體重220 g～250 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。許可證號：SCXK（粵）2008-0002；清潔級昆明種小鼠，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0034，等級：SPF級，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫為20.0℃～24.8℃，相對濕度為46.8%～50.4%RH；天麻素對照品（中國食品藥品檢定研究院，編號62.110807）；乙腈為HPLC級；磷酸為分析純；無水乙醇（分析純）；巴比妥鈉、戊巴比妥鈉廣州健陽生物科技有限公司；天麻（Gastrodia elata Bl.）超微粉(D 5023.77 μm)由湯臣倍健股份有限公司提供，每日成人推薦服用量為2.4 g/人·d，超微粉的粒徑分布圖和掃描電鏡照片見圖 1。微粉的平均粒徑 31.97 μm，D50、D90 分別為23.77 μm、51.22 μm。

由圖1可看出超微粉粉體的粒徑分布曲線呈正態(tài)分布，說明粉體的均勻性，分散性較好。

1.2 天麻超微粉在大鼠體內(nèi)吸收情況

1.2.1 高效液相色譜條件與標準曲線繪制

利用中國藥典1部等報道的HPLC法檢測天麻素[8]，具體條件如下：安捷倫-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為220 nm；柱溫：25℃。精密稱取天麻素標準品5 mg溶解于10 mL乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97），并配制成濃度為 500 μg/mL 的儲備液。精密吸取儲備液，分別稀釋成 0.5、1、5、10、25、50 μg/mL，用孔徑0.22 μm濾膜過濾后，置于樣品瓶中，-20℃冰箱保存待用。按照上述色譜條件進行HPLC測定，作峰面積對濃度的標準曲線，求出直線回歸方程。

圖1 天麻超微粉的粒徑分布圖（A）和掃描電鏡照片（×1000）（B）Fig.1 The size distribution（A）and scanning electron micrograph（B）of Gastrodia elata Bl.ultrafine powder

1.2.2 HPLC法測定天麻超微粉中天麻素的含量

按照張煒等[9]報道方法提取天麻素，具體方法如下：精密稱取天麻超微粉0.1 g，加入10 mL水，靜置過夜，次日超聲30 min，3500 r/min離心10 min，取上清液于35℃減壓濃縮蒸干，加流動相1 mL溶解并定容，過0.45 μm微孔濾膜后進樣。

1.2.3 天麻超微粉中天麻素的生物利用度

取健康雄性SD大鼠9只，實驗前禁食24 h，自由飲水。各組大鼠分別尾靜脈注射天麻素（25 mg/kg）、灌胃天麻超微粉（4 g/kg）。分別于灌胃前和后5、15、30、50、70、90、120、180min 斷尾取血 0.5mL，肝素抗凝，4℃、 3000 r/min離心10 min分離血漿，20℃保存?zhèn)溆谩０凑認u XH等報道的方法進行血漿前處理[10]，精密吸取血漿150 μL，加入乙醇0.5 mL，再渦旋振蕩1 min后于 12000 r/min離心10 min除蛋白，取上清液，然后在室溫下氮氣吹干。分別加500 μL流動相溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣。

1.3 天麻超微粉改善睡眠功能研究

1.3.1 動物分組與處理

參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版）中方法[11]。將健康雌性小鼠，體重 18 g～22 g，120 只，分3批用于試驗，第1批動物用于直接睡眠實驗和延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗，第2批動物用于戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗，第3批動物用于巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗。每批動物按體重隨機分為低、中、高劑量組和1個陰性對照組，每組10只動物。低、中、高劑量組分別為40、400和 1200 mg/kg·BW（分別相當于受試樣品推薦日攝入量的 1、10、30倍）。按 0.2 mL/10 g·BW經(jīng)口灌胃，陰性對照組給予等量溶劑，每日灌胃1次，連續(xù)30 d。

1.3.2 測定指標與方法

按照衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）方法進行。實驗設3個部分：延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗。

1.3.2.1 直接睡眠實驗

觀察受試組動物給予受試樣品后，陰性對照組給予同體積溶劑后，是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標。如超過30 s～60 s不能翻正者，既認為翻正反射消失，進入睡眠。翻正反射恢復即為覺醒，翻正反射消失至恢復這段時間為動物睡眠時間。記錄對照組與受試樣品組入睡動物數(shù)及睡眠時間。

1.3.2.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

在直接睡眠實驗的基礎上進行，如直接睡眠實驗為陰性，則進行延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗。做正式實驗前先進行預實驗，確定使動物100%入睡，但又不使睡眠時間過長的戊巴比妥鈉劑量，用此劑量做正式實驗（本實驗劑量為：32 mg/kg·BW）。動物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后，出現(xiàn)峰作用前10 min～15 min，給各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉，以翻正反射消失為指標，觀察受試樣品能否延長戊巴比妥鈉睡眠時間。

1.3.2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

做正式實驗前先進行預實驗，確定戊巴比妥鈉閾下催眠劑量，即80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉最大閾下劑量。動物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后，出現(xiàn)峰作用前10 min～15 min，給各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量（本實驗劑量為：20 mg/kg·BW），記錄30 min內(nèi)入睡動物數(shù)（翻正反射消失達1 min以上者）。

1.3.2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

做正式實驗前先進行預實驗，確定使動物100%入睡，但又不使睡眠時間過長的巴比妥鈉的劑量，用此劑量正式實驗。動物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品10 min～20 min后，給各組動物腹腔注射巴比妥鈉（本實驗劑量為：295 mg/kg·BW），以翻正反射消失為指標，觀察受試樣品對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。睡眠時間為計量資料，數(shù)據(jù)采用方差分析進行統(tǒng)計，對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。入睡動物數(shù)為計數(shù)資料，采用χ2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻超微粉在大鼠體內(nèi)吸收情況

2.1.1 天麻素的色譜圖及標準曲線

天麻素在220 nm處有最大吸收峰，其保留時間為5.91 min，在血漿樣品中，目標峰也與其他雜峰分離良好。在規(guī)定的色譜條件下，作天麻素濃度X-相應峰面積Y的線性回歸方程，其回歸方程為Y= 18781X+ 2435.7，R2= 9999（圖 2）。

圖2 天麻素標準品液相色譜圖（A）及標準曲線（B）Fig.2 HPLC chromatogram of gastrodin standards（A）and standard curve of gastrodin（B）

2.1.2 天麻超微粉中天麻素的含量

在給定的色譜條件下測定天麻超微粉樣品，測定出的天麻素峰面積積分值后，按對應的線性方程計算其含量，分別測定3次，結(jié)果見表1，本實驗所用受試物天麻超微粉中天麻素的含量0.24%。

表1 天麻超微粉中天麻素含量測定結(jié)果Table 1 The content of gastrodin in the Gastrodia elata Bl.ultrafine powder %

2.1.3 天麻超微粉中天麻素的生物利用度

天麻素在220 nm處有最大吸收峰，其保留時間為5.91 min，在血漿樣品中，目標峰也與其他雜峰分離良好。高效液相色譜儀中測得的各時間點峰面積比值代入到的標準曲線方程中，計算大鼠血漿中天麻素濃度。大鼠血漿中天麻素濃度－時間曲線見圖3，天麻超微粉的絕對生物利用度達60.77%。

圖3 大鼠靜脈注射天麻素、灌胃天麻超微粉后血漿中平均天麻素濃度－時間曲線Fig.3 Mean plasma concentration-time curve of gastrodin i.v.treated group and the Gastrodia elata Bl.ultrafine powder i.g.treated group in rats

2.2 天麻超微粉改善睡眠功能

2.2.1 天麻超微粉對小鼠體重的影響

實驗開始前，稱量實驗小鼠初始體重，并根據(jù)小鼠體重隨機分組。灌胃結(jié)束時，稱量實驗小鼠終體重，并對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，見表2。

表2 天麻超微粉對小鼠體重的影響Table 2 The effect data of Gastrodia elata Bl.ultrafine powder on body weight of mice

從表2可以看出，天麻超微粉低、中、高劑量組的實驗小鼠初始體重和終體重與空白對照組比較差異均不顯著（P＞0.05），表明天麻超微粉對小鼠的體重增長無影響。

2.2.2 天麻超微粉直接睡眠實驗

各試驗組給予受試樣品，陰性對照組給予同體積溶劑后，經(jīng)觀察30 min，翻正反射存在，未出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。

2.2.3 天麻超微粉對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間的影響

各組動物睡眠時間經(jīng)方差齊性檢驗，sig=0.175＞0.05，所以，接受原假設，認為因素是方差相等的，經(jīng)方差分析，其組間差異沒有達到顯著性水平（P＞0.05，表3）。說明該受試樣品沒有顯著延長戊巴比妥鈉睡眠時間的作用。

表3 天麻超微粉對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間的影響Table 3 Effects of tested drug on sleep time induced by pentobarbital sodium in mice

2.2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

低、中、高劑量組動物入睡率與陰性對照組相比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表4）。說明該受試樣品可以增加戊巴比妥鈉閾下劑量動物入睡率。

表4 天麻超微粉對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響Table 4 Effects of test drug with sub-threshold dose of sodium pentobarbital on sleeping rate of mice

2.2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

低、中、高劑量組動物巴比妥鈉睡眠潛伏期與陰性對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05，表5）。說明該受試樣品可使睡眠潛伏期縮短，受試樣品與巴比妥鈉有協(xié)同作用。

表5 天麻超微粉對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響Table 5 Effect of tested drug with sodium barbital on the sleep incubation period of mice

3 討論與結(jié)論

天麻中主要活性成分為天麻素，本實驗所用受試物天麻超微粉中含有天麻素含量0.24%，天麻素的絕對生物利用度達60.77%，較接近直接灌胃天麻素的生物利用度[12]，說明微粉化處理有利于天麻有效成分的消化吸收。本研究結(jié)果表明，經(jīng)口灌胃給予小鼠不同的受試物30 d，空白對照組、天麻超微粉三個劑量組小鼠在60 min內(nèi)，均未發(fā)現(xiàn)有直接睡眠現(xiàn)象，并且該天麻超微粉對小鼠的體重增加無明顯影響。40、400和 1200 mg/kg·BW天麻均具有協(xié)同戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用，能縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期，提示該天麻與戊巴比妥鈉和巴比妥鈉有明顯的協(xié)同作用，根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003年版）中的判定標準，該天麻超微粉具有改善睡眠功能作用。此結(jié)果與齊麗娟等[13]的研究結(jié)果相似，但本實驗中天麻粉的灌胃劑量顯著低于上述報道中普通粉的灌胃劑量（約為1/2劑量），原因可能是超微粉化能增加比表面積和孔隙率，進而提高有效成分在體內(nèi)的吸收率。胥佳等發(fā)現(xiàn)超微粉碎處理有利于葡萄籽中原花青素的釋放[14]，劉素穩(wěn)等研究發(fā)現(xiàn)超微粉碎能顯著提高鮑菇粉的比表面積和多糖溶出率[15]，這些體外實驗也證明超微粉化能提高有效成分的溶出和釋放。本實驗結(jié)果表明微粉化能夠提高天麻粉中天麻素的生物利用度，進而提高其改善睡眠功能的效果。本研究為天麻超微粉功能食品的制劑開發(fā)與應用提供科學依據(jù)。

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