昆蟲JHE 基因結構及與甲基化相關的CpG O/E 值分析

張 梅，周曉穗，陳佳林，梁士可，李廣宏，王方海

(中山大學生命科學學院昆蟲學研究所/有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣州 510275)

昆蟲保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase，JHE)是由昆蟲脂肪體和上皮細胞合成和分泌(楊文佳等，2010)。在昆蟲整個世代發(fā)育過程中，JHE 基因因受到許多因子的調控而能在不同齡期的不同組織中適時地表達，表現(xiàn)出很強的時間特異性，對調節(jié)昆蟲保幼激素滴度水平和控制昆蟲生長發(fā)育過程起著非常重要的作用(馬蘭等，2012)。

表觀遺傳乃是基因表達的重要調控方式之一，而DNA 甲基化是表觀遺傳修飾的主要形式，在昆蟲中業(yè)已證明普遍存在(Field，2004)。DNA 甲基化并沒有改變基因序列，而是通過抑制某些基因的活性，從而調控基因的表達，對調節(jié)昆蟲的某些生物學功能以及適應其生存環(huán)境有著重要作用。DNA 甲基化主要發(fā)生在CpG 位點的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶，故基因組序列中的CpG 位點與DNA 甲基化存在著一定的關聯(lián)，研究發(fā)現(xiàn)CpG 二核苷酸在特定長度基因序列中的實際出現(xiàn)值與預測期望值之間的比值(即CpG O/E 值)是衡量或預測基因中CpG 位點甲基化水平的重要參數(shù)(Glastad et al.，2011)。

DNA 甲基化不僅發(fā)生在基因的5'端啟動子區(qū)域，同時可能發(fā)生在基因的外顯子或內含子區(qū)域中(Huang et al.，2006)。目前已經(jīng)克隆出多種昆蟲的JHE 基因，但多數(shù)報道的是保幼激素酯酶蛋白質編碼序列，對該基因的外顯子和內含子等序列結構進行進一步分析的則很少。本研究在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了已公布的4種昆蟲的全基因組序列和完整的JHE 基因序列，通過序列比對分析確定各JHE 基因的外顯子和內含子等結構區(qū)域，然后對各個區(qū)域的CpG 位點進行統(tǒng)計并計算出CpG O/E 值，分析這些區(qū)域可能的甲基化情況，為進一步明確JHE 基因的完整結構和今后進行其甲基化和基因表達調控方面的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 確定已獲得全基因組數(shù)據(jù)和完整保幼激素酯酶序列的物種

通過從NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找，篩選目前已經(jīng)在數(shù)據(jù)庫中公布基因組數(shù)據(jù)的昆蟲類物種，再從這些物種中篩選出已公布完整的JHE 基因序列的物種，發(fā)現(xiàn)主要有西方蜜蜂Apis mellifera、黃翅菜葉峰Athalia rosae、煙草天蛾Manduca sexta、家蠶Bombyx mori、黑腹果蠅Drosophila melanogaster、致倦庫蚊Culex quinquefasciatus、赤擬谷盜Tribolium castaneum 等7個物種。由于煙草天蛾、黃翅菜葉峰等蟲種雖然已經(jīng)在NCBI 數(shù)據(jù)庫中提供了基因組數(shù)據(jù)，但該數(shù)據(jù)庫中未提供將序列與全基因組序列比對的功能，因此，在本次研究中選擇了西方蜜蜂、黑腹果蠅、致倦庫蚊和家蠶四種昆蟲來進行隨后的JHE 基因結構和CpG O/E 值研究和分析。

1.2 基因組中JHE 各個結構的定義及獲取

1.2.1 JHE 基因翻譯起始位點的確定

從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載西方蜜蜂、黑腹果蠅、致倦庫蚊和家蠶四種昆蟲的JHE 序列以及全基因組序列。運用DNASTAR 軟件查找黑腹果蠅、致倦庫蚊和家蠶的JHE 基因序列中的開放閱讀框并翻譯成氨基酸序列，再將此序列與NCBI 中已公布的相應JHE 基因蛋白質序列比對，如果高度相似就可確定其翻譯起始位點。而西方蜜蜂JHE 基因翻譯起始位點的確定主要是參考已有的文獻報道(Mackert et al.，2008)。

1.2.2 JHE 基因翻譯起始前調控區(qū)域的確定

在本次研究中，使用三種軟件預測JHE 基因的啟動子序列，得到的結果不同，這三個軟件分別是PromoterScan(http:∥www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)、Neural Network Promoter Prediction(http:∥www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)、Promoser(http:∥biowulf.bu.edu/zlab/PromoSer/)。本次研究為了也能夠對JHE基因的上游調控區(qū)域進行CpG 位點和CpG O/E 值的統(tǒng)計分析，我們將JHE 基因翻譯起始位點上游的2000 bp 區(qū)域全部截下來進行詳細分析，因為這段區(qū)域基本覆蓋了包括啟動子和增強子等各類調控素(Scherf et al.，2000;Zemach et al.，2010)。同時將2000 bp 區(qū)域具體劃分為四段，每段長度為500 bp，以最接近翻譯起始位點的那一段命名為R4，依次將前面三段命名為R3、R2、R1，R1 區(qū)域距離翻譯起始位點最遠。

1.2.3 JHE 基因外顯子、內含子序列的獲取

運用NCBI 的Spidey 在線軟件將各JHE 基因與其相應的基因組序列作比對，發(fā)現(xiàn)JHE 基因編碼序列在全基因組序列中被很多非編碼序列隔開，從基因翻譯起始位點開始被隔開的編碼序列即為外顯子，插入編碼序列中與編碼序列相鄰的非編碼序列則為內含子，所得序列均以fasta 格式保存。

1.3 CpG 位點的統(tǒng)計方法及CpG O/E 值的定義

DNA 甲基化通常發(fā)生在基因中胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，即在基因組序列中CpG 位點的C 上，因此，基因組序列中CpG位點相關信息的獲得對DNA 甲基化研究具有重要意義。在本次研究中，使用在線軟件softberry-CpGFinder 對基因組中JHE 基因序列的CpG 位點進行統(tǒng)計分析，計算出CpG 位點數(shù)在特定長度的基因序列中所占的比率(PCpG)以及C、G 位點各占的比率(PC、PG)。CpG O/E 值為CpG 二核苷酸在特定長度基因序列中的實際出現(xiàn)值與預測期望值之間的比值，計算公式為CPG O/E=是衡量或預測基因中CpG 位點的甲基化水平的重要參數(shù)(Elango et al.，2009)。

2 結果與分析

2.1 目前已公布基因組序列的昆蟲

通過在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找，目前已公布基因組序列的昆蟲共70 余種;其中雙翅目Diptera 昆蟲有40 余種，膜翅目Hymenoptera 17種，鱗翅目Lepidoptera 5種，半翅目Hemiptera 2種，鞘翅目Coleoptera 2種，捻翅目Strepsiptera 2種，虱目Anoplura 1種，蜻蜓目Odonata 1種;雙翅目中果蠅科和蚊科居多，有少數(shù)的毛蠓科，膜翅目中蟻科居多。而已公布完整的JHE 基因序列的物種也有7個。但在NCBI 數(shù)據(jù)庫中能夠提供JHE 基因序列與全基因組序列比對功能的則只有4個物種，分別為西方蜜蜂、黑腹果蠅、致倦庫蚊和家蠶。

2.2 種昆蟲JHE 基因大小及結構

4種昆蟲JHE 基因在GenBank 的具體登記號和長度見表1，黑腹果蠅的序列長度為2326 bp，最短;家蠶的最長，達17998 bp;西方蜜蜂和致倦庫蚊的序列長度則介于前2 者之間，分別為2805 bp、11048 bp。將這些昆蟲的JHE 基因與其基因組序列比對后發(fā)現(xiàn)西方蜜蜂JHE 基因含有7個外顯子和6個內含子，而其余三種昆蟲的JHE基因均含有6個外顯子和5個內含子，外顯子的長度多數(shù)在150-400 bp 之間。西方蜜蜂和黑腹果蠅的JHE 基因內含子較短，多數(shù)短于100 bp，最長的也只有171 bp;家蠶JHE 基因的內含子長度較長，最短的也有436 bp，而最長的則達12050 bp;致倦庫蚊的JHE 基因內含子長度不均，差異較大，最短的僅53 bp，最長的為7616 bp。

表1 四種昆蟲JHE 基因及其外顯子和內含子的結構組成Table 1 JHE genes from four species of insects and their composition of exons and introns

2.3 JHE 基因各個區(qū)域CpG 位點分析

通過對四種昆蟲的JHE 基因序列各個區(qū)域進行統(tǒng)計分析得知，發(fā)現(xiàn)西方蜜蜂的第1、2、5、6內含子和致倦庫蚊的第3 內含子區(qū)域沒有CpG 位點(表2)?？傮w來看，JHE 基因上游2000 bp 區(qū)域(R1-R4)的CpG 位點數(shù)在四種昆蟲中顯示出一定的差異:西方蜜蜂的最少，總數(shù)為25;黑腹果蠅的最多，總數(shù)達94;致倦庫蚊和家蠶的則介于兩者之間，總數(shù)分別為61、87。此外，在西方蜜蜂和黑腹果蠅這兩種昆蟲中，JHE 基因的外顯子區(qū)域所具有的CpG 位點數(shù)明顯多于內含子區(qū)域所具有的，如蜜蜂7個外顯子區(qū)域所具有的CpG位點總數(shù)為48，而6個內含子區(qū)域所具有的CpG位點總數(shù)只有3。

表2 JHE 基因各個區(qū)域CpG 位點數(shù)量Table 2 The quantity of CpG sites in JHE gene regions

2.4 JHE 基因各個區(qū)域CpG O/E 值分析

JHE 基因各個區(qū)域CpG O/E 值見表3，除了5個內含子區(qū)域因無CpG 位點而導致CpG O/E 值為零外，其余區(qū)域的CpG O/E 值最低為黑腹果蠅第一外顯子的0.3849，最高為家蠶第一外顯子的2.8571，無明顯規(guī)律可言。但根據(jù)JHE 基因各個區(qū)域CpG O/E 值的平均值來看，則有一定的規(guī)律，見圖1，第1 到第4 外顯子的CpG O/E 平均值較低，只有0.8 左右，明顯低于其它各個區(qū)域的CpG O/E 平均值。

圖1 四種昆蟲JHE 基因各區(qū)域CpG O/E 的平均值Fig.1 The average values of CpG O/E in every region of four insects JHE genes

表3 JHE 基因CpG O/E 值Table 3 The CpG O/E value of JHE gene

3 結論與討論

對不同昆蟲的JHE 基因結構分析表明，JHE基因均由較多的外顯子和內含子相間組成，由于含有的內含子序列長度差異較大，致使不同昆蟲JHE 基因的序列長度差異也較大，如黑腹果蠅的內含子較短，最長的內含子也僅有171 bp，故其JHE 基因較短，序列長度為2326 bp;而家蠶的內含子則較長，其中有一個內含子達到了12050 bp，導致其JHE 基因也相對較長，序列總長度達到了17998 bp(見表1)。

由于JHE 基因產(chǎn)物主要調控生長發(fā)育過程中起重要作用的保幼激素的滴度水平，故其產(chǎn)物表達水平并不是固定不變的，而是隨著昆蟲發(fā)育周期的變化而變化的，因此這就需要JHE 基因本身具有較高的表達調控能力，我們推測昆蟲JHE 基因含有較多的內含子，可能與其轉錄表達調控有關，目前已有大量文獻報道真核mRNA 內含子在真核生物基因表達調控中起著重要的作用(Wang et al.，2008)。

CpG O/E 值，即CpG 的實際值與期望值之間的比值，是預測基因組中CpG 位點甲基化水平的重要參數(shù)，如果CpG O/E 值較大，表明該區(qū)域的甲基化水平較低;CpG O/E 值較小，則表明該區(qū)域的甲基化水平較高(Elango et al.，2009;Glastad et al.，2011)。本次研究發(fā)現(xiàn)四種昆蟲的JHE 基因各個區(qū)域的CpG O/E 平均值的大小依次為:基因上游2000 bp 區(qū)＞內含子區(qū)＞外顯子區(qū)，R1-R4(涵蓋基因上游2000bp 區(qū))的CpG O/E平均值均大于1.0，而第1 到第4 外顯子的CpG O/E 平均值均只有0.8 左右(圖1)。這表明在昆蟲JHE 基因中，若有CpG 甲基化位點存在，應主要發(fā)生在第1 到第4 外顯子區(qū)域，而不是基因上游啟動子區(qū)域或間隔外顯子的內含子區(qū)域。這與Glastad 等人在有關昆蟲甲基化綜述中所提到的觀念一致，即昆蟲甲基化主要發(fā)生在基因主體上(Glastad et al.，2011)。同時通過全基因組測序，在西方蜜蜂和家蠶中，也已發(fā)現(xiàn)CpG 位點甲基化主要發(fā)生在各個基因主體的外顯子中(Elango et al.，2009;Xiang et al.，2010)。

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