高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛羊組織中苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥多殘留

李帥鵬+黃顯會(huì)+王偉+嚴(yán)常燕+孔祥凱??

摘 要 建立了高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛、羊組織中硝碘酚腈、氯羥柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的多殘留檢測(cè)方法。樣品用乙腈 丙酮（60∶40，V/V）（肌肉、肝臟和腎臟組織）或1%三乙胺乙腈（脂肪組織）超聲提取，MAX陰離子固相萃取柱凈化，液相色譜分離，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式對(duì)4種藥物同時(shí)進(jìn)行定性定量分析，在1～100 μg/L 范圍內(nèi)，4種藥物與其對(duì)應(yīng)峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。在牛、羊組織中的檢出限（LOD）均為1 μg/kg，定量限（LOQ）均為2.5 μg/kg。 在LOQ、0.5倍最高殘留限量（MRL）、MRL、2倍MRL添加水平下，4 種藥物的平均回收率在71%～112%之間，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.1%～14.0%之間，日間RSD在6.4%～14.7%之間。采用本方法對(duì)市場(chǎng)上動(dòng)物可食性組織進(jìn)行抽樣檢測(cè)，共抽檢40份樣品，2份樣品檢測(cè)出苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥殘留。

關(guān)鍵詞 苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥； 牛羊組織； 多殘留； 高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

氯羥柳胺（OXY）、硝碘酚腈（NIT）、氯氰碘柳胺（CLO）、碘醚柳胺（RAF）是一類苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥，作用機(jī)理是通過阻斷肝片吸蟲的氧化磷酸化過程，使蟲體麻痹、死亡，用于驅(qū)殺牛、羊的肝片吸蟲、蛔蟲和絳蟲，對(duì)血毛線蟲、巨片吸蟲和羊蠅蛆亦有較好作用。隨著國(guó)內(nèi)驅(qū)蟲藥的廣泛應(yīng)用和研究，發(fā)現(xiàn)碘醚柳胺有明顯胚胎毒性[1]； 氯氰碘柳胺對(duì)肝、腎具有一定的毒、副作用[2]； 高劑量硝碘酚腈可引起心臟、神經(jīng)、肌肉和呼吸的損害[3]。歐洲醫(yī)藥評(píng)價(jià)署、澳大利亞以及食品法典委員會(huì)均已制定了上述藥物的最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL），殘留標(biāo)志物均為原形藥物，殘留監(jiān)測(cè)的動(dòng)物是牛羊。靶組織MRL分別如下：硝碘酚腈：牛、羊，肌肉400 μg/kg、脂肪200 μg/kg、肝20 μg/kg、腎400 μg/kg。碘醚柳胺：牛，肌肉30 μg/kg、脂肪30 μg/kg、肝10 μg/kg、腎40 μg/kg； 羊，肌肉100 μg/kg、脂肪250 μg/kg、肝150 μg/kg、腎150 μg/kg。氯氰碘柳胺：牛，肌肉1000 μg/kg、脂肪3000 μg/kg、肝1000 μg/kg、腎3000 μg/kg； 羊，肌肉1500 μg/kg、脂肪2000 μg/kg、肝1500 μg/kg、腎5000 μg/kg。氯羥柳胺：牛、綿羊，肌肉20 μg/kg、脂肪20 μg/kg、肝500 μg/kg、腎100 μg/kg。我國(guó)農(nóng)業(yè)部（2003）235號(hào)公告[4]已經(jīng)頒布硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺的最高殘留限量，氯羥柳胺的最高殘留限量正在制定中。

目前，關(guān)于苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在組織中殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜與紫外檢測(cè)器[5～8]、熒光檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用[9，10]、高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法[11～16]。國(guó)內(nèi)僅報(bào)道高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法[9]檢測(cè)氯氰碘柳胺在牛組織和牛奶中殘留的研究，國(guó)外對(duì)于苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在組織中殘留分析方法的報(bào)道主要局限于某種組織或者是單殘留和兩種藥物的殘留檢測(cè)方法，尚未報(bào)道關(guān)于4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在牛、羊組織中的多殘留檢測(cè)方法。本研究采用HPLC MS/MS分析牛、羊組織中4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的多殘留，方法前處理簡(jiǎn)便易行，靈敏度高，精密度及重復(fù)性好，適用于牛、羊組織中苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的多殘留檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200型液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）； API4000電噴霧 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配Analyst 4.1.5 軟件（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）； C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm， 美國(guó)Waters公司）； Centrifuge5804臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf公司）； D10 24型氮?dú)鉂饪s儀（杭州奧盛儀器有限公司）； Milli Q純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）； CNWBOND MAX固相萃取小柱（60 mg/3 mL，德國(guó)CNW科技公司）。

硝碘酚腈（Nitroxinil，NIT）精制對(duì)照品（純度98.5%，批號(hào) 091205），氯羥柳胺（Oxyclozanide，OXY）精制對(duì)照品（純度98.5%，批號(hào)1670811），氯氰碘柳胺鈉（Closantel，CLO）精制對(duì)照品（純度94.1%，批號(hào) 67111001），碘醚柳胺（Rafoxanide，RAF）精制對(duì)照品（純度99.5%， 批號(hào) 0505028），均購(gòu)自河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司； 乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，德國(guó)CNW科技公司）； 乙酸銨（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）； 氨水、冰醋酸（分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取適量的硝碘酚腈、氯羥柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺對(duì)照品，用乙腈分別配制成1 g/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。1%三乙胺 乙腈溶液：取1.0 mL三乙胺，用乙腈定容至100 mL，混勻。25% 氨化乙腈溶液：取25.0 mL氨水，用乙腈定容至100 mL，混勻。5%甲酸 乙腈溶液；0.1%甲酸溶液。

2.3 色譜 質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）； 流速： 0.25 mL/min； 柱溫： 35 ℃； 進(jìn)樣量： 5 μL； 流動(dòng)相： 甲醇（A）， 乙腈（B）， 0.1%甲酸溶液（C）。梯度洗脫程序： 0.0 min， 15%A， 25%B； 0.0～1.0 min， 15%～30%A， 25%～70%B； 1.0～6.0 min， 30%A， 70%B； 6.0～6.5 min， 30%～15%A， 70%～25%B； 6.5～13.0 min， 15%A， 25%B。

2.3.2 質(zhì)譜條件 用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式； 電噴霧離子源（ESI）； 負(fù)離子掃描； 電噴霧電壓

Symbolm@@ 3500 V， 離子源溫度 650 ℃，氣簾氣壓力15 kPa，霧化氣壓力60 kPa，輔助氣壓力 60 kPa。射入電壓、碰撞能量、去簇電壓、碰撞室射出電壓及定性離子對(duì)、定量離子對(duì)等參數(shù)見表1。

2.4 樣品的處理與凈化

（1）肌肉、肝臟、腎臟組織樣品 已勻漿組織樣品在室溫下自然解凍，準(zhǔn)確稱?。?.00±0.02）g，置于50 mL離心管中， 加入乙腈 丙酮混合液（60∶40，V/V）15 mL，漩渦混懸15 s，超聲提取10 min，300 r/min振搖10 min，8000 r/min 離心10 min后收集上清液； 上清液中加入1 mL 5%氨水待凈化。（2）脂肪組織樣品 已勻漿組織樣品在室溫下自然解凍，準(zhǔn)確稱?。?.00±0.02）g，置于50 mL離心管中，加入1%三乙胺 乙腈溶液15 mL，漩渦混懸15 s，超聲提取10 min，300 r/min振搖10 min，8000 r/min 離心10 min后收集上清液； 上清液中加入2 mL 5%氨水后， 置于

Symbolm@@ 20 ℃冷藏1 h，取出后在4 ℃下8000 r/min離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50 mL離心管中，待凈化。

MAX固相萃取柱預(yù)先用25%氨化 乙腈溶液3 mL活化，再將前述上清液裝載入柱，以1.0 mL/min流速過柱。待上清液流出后，依次用3 mL水和3 mL甲醇分別淋洗，負(fù)壓抽干后用5%甲酸 乙腈溶液3 mL洗脫，收集洗脫液，在40 ℃下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?.5 mL流動(dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，加入乙腈飽和的正己烷0.5 mL，渦旋，于4 ℃下15000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜參數(shù)的確定

用針泵連續(xù)直接進(jìn)樣（單一標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mg/L），發(fā)現(xiàn)ESI

準(zhǔn)分子離子峰。優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)，進(jìn)行相應(yīng)的子離子全掃描，以確定MRM特征診斷離子。根據(jù)歐盟 2002/657/EC[20]制定的分析方法確認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)和程序規(guī)定，各藥物的母離子、子離子及部分質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3. 2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇 由于硝碘酚腈、氯羥柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺的脂溶性較高、極性小，所選色譜柱的固定相應(yīng)為直鏈烷烴鍵合的硅膠，其中最常見的為十八烷基鍵合硅膠（即C18）。本研究考察了菲羅門Gemini C18（150 mm×2.0 mm， 5 μm）、CNW C18（250 mm×4.6 mm，5

和Waters C18 （150 mm×2.1 mm，3.5 μm）填料的色譜柱。氯氰碘柳胺和碘醚柳胺在Gemini C18色譜柱上峰形較寬，在樣品檢測(cè)時(shí)基質(zhì)雜音較大； 在CNW C18色譜柱上，由于氯氰碘柳胺和碘醚柳胺極性較弱，當(dāng)加大乙腈的比例后，這兩者的分離效果不理想，而且純標(biāo)液的基線在后， 兩種藥物出峰之前容易漂移； Waters C18色譜柱對(duì)4種藥物有良好的保留性質(zhì)，各待測(cè)藥物均可得到優(yōu)異的峰型。因此采用Waters C18 色譜柱。

3.2.2 流動(dòng)相的選擇 比較了甲醇或乙腈（有機(jī)相）與乙酸銨緩沖溶液、甲酸水溶液、超純水（水相）組合對(duì)峰型、靈敏度及分辨率的影響。研究表明， 選擇甲醇或乙腈作為有機(jī)相， 均可對(duì)4種藥物進(jìn)行有效的分離，但是在甲醇為流動(dòng)相時(shí)，硝碘酚腈的出峰時(shí)間在10.26 min，以乙腈為流動(dòng)相時(shí)，硝碘酚腈的出峰時(shí)間在3.72 min。為了縮短藥物的出峰時(shí)間和優(yōu)化4種藥物的峰形，選擇乙腈和甲醇作為流動(dòng)相。考察了甲醇或乙腈（有機(jī)相）與5 mmol/L乙酸銨、10 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸溶液在不同梯度條件下對(duì)藥物峰的影響，發(fā)現(xiàn)乙酸銨的加入，未能改善氯氰碘柳胺和碘醚柳胺的峰形， 峰形較寬，基質(zhì)雜音較大。當(dāng)選擇乙腈和0.1%甲酸溶液時(shí)，需要加大有機(jī)相的比例才能對(duì)將氯氰碘柳胺和碘醚柳胺洗脫。當(dāng)選擇0.1%甲酸 乙腈 甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，采用2.3.1節(jié)所示方法進(jìn)行梯度洗脫，4種藥物均可得到良好的峰型。

3.3 樣品前處理方法的研究

根據(jù)4種藥物的理化性質(zhì)以及文獻(xiàn)＼[12，18，19]，考察了乙腈、1%三乙胺乙腈和1%醋酸丙酮、乙腈 丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等的提取效果。發(fā)現(xiàn)甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯不能有效地提取這4種藥物，回收率在40%～70%； 用乙腈或1%三乙胺乙腈時(shí)，提取回收率均能達(dá)到80%以上； 用1%醋酸丙酮提取后，加入5 mL氨水，出現(xiàn)較多雜質(zhì)，且回收率不穩(wěn)定（60%～75%）； 乙腈 丙酮混合液提取時(shí)，回收率均能達(dá)到80%以上，且乙腈 丙酮（60∶40，V/V）回收率偏高于乙腈 丙酮（80∶20，V/V）。乙腈具有較強(qiáng)的除蛋白和脫脂作用，對(duì)脂肪溶解性差，經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn)1%三乙胺乙腈作為脂肪組織的提取劑回收率較好，乙腈 丙酮（60∶40，V/V）對(duì)肌肉、肝臟、腎臟均有較好的提取效果。由于4種藥物為弱酸性藥物，且乙腈和丙酮的極性較強(qiáng)，過柱后， 硝碘酚腈的回收率在65%～70%，5%氨水溶液為堿性環(huán)境，通過加入5%氨水可以使4種藥物給出質(zhì)子，呈陰離子態(tài)，有利于其在陰離子交換柱上被保留。實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)比加入1、2和4 mL 5%氨水溶液，發(fā)現(xiàn)在肌肉、肝臟、腎臟提取液中加入1 mL 5%氨水溶液，在脂肪提取液中加入2 mL 5%氨水溶液，4種藥物的回收率在80%～110%之間。

凈化過程中，根據(jù)苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的理化性質(zhì)，直接比較了菲羅門 Strata X 柱、MAX柱的凈化效果，發(fā)現(xiàn)硝碘酚腈和碘醚柳胺有很好的保留，回收率均在80%以上，而氯羥柳胺和氯氰碘柳胺在Strata X柱上的回收率較差，分別約為55%和32%。因此選用MAX小柱，對(duì)比了CNW MAX（60 mg/3 mL）、CNW MAX（500 mg/6 mL）及Waters MAX（60 mg/3 mL）3種小柱的凈化效果。發(fā)現(xiàn)4種藥物在CNW MAX柱的回收率均在80%。 考慮實(shí)驗(yàn)成本，最終選擇CNW MAX（60 mg/3 mL）小柱。

圖1和圖2為4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的MRM色譜圖。4種藥物依次是硝碘酚腈、氯羥柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺，保留時(shí)間依次為6.29， 7.03， 8.22和8.47 min。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)

樣品基質(zhì)溶液對(duì)目標(biāo)物的電噴霧離子化有很大影響，可增強(qiáng)或抑制信號(hào)響應(yīng)，進(jìn)而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度。本實(shí)驗(yàn)在空白組織基質(zhì)提取液中添加不同濃度的苯酚類和水楊酸苯胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與相應(yīng)流動(dòng)相（純?nèi)軇┲械男盘?hào)強(qiáng)度（峰面積）相比較，發(fā)現(xiàn) 4 種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在組織中的響應(yīng)值均低于純?nèi)軇?。為了降低基質(zhì)效應(yīng)，采用MAX固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，使離子抑制效應(yīng)明顯降低。其次，優(yōu)化色譜分離條件，分離內(nèi)源性物質(zhì)。由于基質(zhì)效應(yīng)主要出現(xiàn)在出峰較早的時(shí)間段，所以使用梯度洗脫方法調(diào)節(jié)分析物與內(nèi)源性物質(zhì)的出峰時(shí)間，使二者分離。此外，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)法定量分析，消除基質(zhì)效應(yīng)。

3.5 線性范圍與檢出限

為減少或消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法獲得組織樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取2 g組織于50 mL 離心管中，按照2.4節(jié)方法處理，在空白樣品經(jīng)提取凈化吹干后的殘余物中添加標(biāo)準(zhǔn)工作液，得1， 2， 5， 10， 50和100 μg/L的基質(zhì)加標(biāo)溶液，用 HPLC MS/MS 分析，每個(gè)濃度平行測(cè)定5次。超出100 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液用空白樣品基質(zhì)提取液稀釋至1～100 μg/L范圍內(nèi)，進(jìn)行LC MS/MS測(cè)定，用于單點(diǎn)法校準(zhǔn)。按所得峰面積平均值對(duì)相應(yīng)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積（y）對(duì)其質(zhì)量濃度（x，μg/L）作圖，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。采用空白組織添加低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.4節(jié)方法進(jìn)行處理后檢測(cè)，以信噪比S/N≥3確定檢出限（LOD），以S/N≥10 確定定量限（LOQ）。

結(jié)果表明，4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在1～100 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.9901～0.9999之間，檢出限均為1 μg/kg，定量限均為2.5 μg/kg，滿足殘留檢測(cè)的要求。

3.6 準(zhǔn)確度與精密度

采用相應(yīng)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液?jiǎn)吸c(diǎn)校正法計(jì)算回收率，按照LOQ， 0.5 MRL， MRL， 2MRL作為添加濃度，每個(gè)添加水平平行5份同日測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5日，結(jié)果表明，4 種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的平均回收率為71%～112% ，日內(nèi)RSD為1.1%～14.0%，日間RSD為6.4%～14.7%（表2），說明方法的重復(fù)性好，通用性強(qiáng)，可滿足牛羊組織中4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥殘留檢測(cè)的要求。

3.7 抽樣檢測(cè)

從市場(chǎng)購(gòu)買牛、羊的脂肪、肌肉各100 g，整個(gè)腎臟，整個(gè)肝臟。每種動(dòng)物每種組織樣品各取5份，共抽檢40份樣品，每份樣品平行2個(gè)樣，按本方法進(jìn)行制樣和檢測(cè)。結(jié)果表明，1份羊腎臟檢測(cè)出13 μg/kg硝碘酚腈殘留，1份牛肝臟檢測(cè)出45 μg/kg氯氰碘柳胺殘留，其余樣品未檢測(cè)出苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥殘留。綜上可知，本方法可檢測(cè)牛、羊肌肉、脂肪、肝臟和腎臟組織中苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的殘留量，適用于檢測(cè)動(dòng)物可食性組織中苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的殘留。

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