激光剝蝕 電感耦合等離子體質(zhì)譜法原位分析印度芥菜中Cd、P、S、Cu等7種元素

楊紅霞+趙令浩+高津旭+劉崴+李冰??

摘 要 建立了莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的LA ICP MS原位分析及二維成像方法，并研究了其在鎘富集型印度芥菜莖中的分布特征。印度芥菜經(jīng)50

SymbolmA@ mol/L Cd處理14 d后，利用包埋劑包埋，冷凍切片后，用Nd：YAG laser（213 nm）器掃描，激光剝蝕 電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP MS）測(cè)定各元素強(qiáng)度，同時(shí)選擇13C作為內(nèi)標(biāo)元素，對(duì)各元素強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。結(jié)果表明，在富集型印度芥菜莖部，Cd大量積聚于由韌皮部與木質(zhì)部組成的維管組織中，除此以外，莖的韌皮部細(xì)胞中及表皮層也分布著大量的Cd。7種元素的分布相關(guān)性表明，Cd與Ca具有相似的分布規(guī)律，而K和Ca， P和S的分布呈顯著正相關(guān)。說(shuō)明重金屬元素進(jìn)入植株體內(nèi)并被其吸收運(yùn)輸過(guò)程是伴隨著植物對(duì)其它元素的吸收，且具有相似的運(yùn)輸機(jī)制。本研究建立的元素原位分析方法證明LA ICP MS在植物樣品中元素空間分布的研究方面具有很大的潛力。

關(guān)鍵詞 激光剝蝕 電感耦合等離子體質(zhì)譜法； 印度芥菜； 原位分析； 鎘； 磷

1 引 言

近年來(lái)，研究重金屬在植物細(xì)胞中的微區(qū)分布漸漸成為探索植物耐性機(jī)理的熱點(diǎn)，基于同步輻射微區(qū)XRF是原位分析Cd的有力工具，Isaure等[1]利用SRXRF分析生長(zhǎng)在Cd 污染土壤的Arabidopsis thaliana葉片，發(fā)現(xiàn)Cd主要分布在葉片的毛狀體。Fukuda等[2]在Cd超積累植物Arabidopsis halleri的葉片同樣發(fā)現(xiàn)Cd 也分布在毛狀體上，并且Zn和Mn的分布與Cd相似。但Küpper等[3]利用SEM EDX研究卻發(fā)現(xiàn)Cd主要分布在Arabidopsis halleri的葉肉細(xì)胞。近年來(lái)也有研究將LA ICPMS應(yīng)用于生物樣品的測(cè)試的報(bào)道，盡管具有缺乏植物激光固體標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)物質(zhì)，而使用其它固體標(biāo)樣時(shí)，可能由于基體效應(yīng)而影響測(cè)試結(jié)果，但當(dāng)只需相對(duì)定量數(shù)據(jù)以便比較樣品中不同元素分布情況時(shí)，激光剝蝕 電感耦合等離子體質(zhì)譜法（LA ICP MS）被證明是一種有效的半定量分析方法[4～10]。Tian等[11]利用LA ICPMS技術(shù)結(jié)合熒光探針染色技術(shù)對(duì)超積累東南景天（HE）葉中Cd等元素的分布特征進(jìn)行原位分析。結(jié)果表明，Cd在維管組織和上皮層較高，而下表皮的分布相對(duì)較低；Zn主要分布在上下表皮細(xì)胞中。

理想的樣品無(wú)損處理技術(shù)應(yīng)能利用最小的樣品量對(duì)污染物暴露情況進(jìn)行準(zhǔn)確且有代表性評(píng)價(jià)[12]，將LA ICPMS應(yīng)用于生物介質(zhì)中微量元素分析具有很大潛力，目前在該領(lǐng)域中的應(yīng)用多集中于環(huán)形生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)， 如樹(shù)環(huán)[13]、軟體動(dòng)物殼[14，15]和魚(yú)耳石[16]。本研究采用LA ICPMS建立了莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的原位微區(qū)分析及二維成像方法，并研究了其在Cd富集型印度芥菜莖中的分布特征。從細(xì)胞水平上揭示超積累植物中Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)和富集規(guī)律。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器條件與參數(shù)

LA ICP MS分析采用Element II高分辨率質(zhì)譜（ThermoFisher公司）及UP213 Nd：YAG深紫外激光燒蝕系統(tǒng)（New Wave），采用NIST612進(jìn)行儀器調(diào)節(jié)，氧化物產(chǎn)率（232Th16O+/232Th+）低于0.3%，有效降低氧化物對(duì)待測(cè)元素的干擾，激光剝蝕采用線掃方式，行與行的間隔為10

SymbolmA@ m。具體工作參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 植物培養(yǎng)

植物材料為富集型印度芥菜，印度芥菜種子（426308）由美國(guó)農(nóng)業(yè)部種子資源庫(kù)提供，種子進(jìn)萌發(fā)后，播種于基質(zhì)中，在基質(zhì)中生長(zhǎng)20 d，轉(zhuǎn)移到1/4營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)8 d，再采用全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)液組成為：Ca（NO3）2 2.00 mmol/L，KH2PO4 0.10 mmol/L，MgSO4 0.50 mmol/L，KCl 0.10 mmol/L，K2SO4 0.70 mmol/L， H3BO3 10.00 μmol/L，MnSO4 0.50 μmol/L，ZnSO4 1.0 μmol/L，CuSO4 0.20 μmol/L，（NH4）6Mo7O24 0.01 μmol/L，F(xiàn)e EDTA 100 μmol/L。每天用0.1 mol/L HCl 或者0.1 mol/L NaOH 調(diào)營(yíng)養(yǎng)液至pH≈5.8，保持全天候通氣，每3 d換一次營(yíng)養(yǎng)液。植物在溫室自然光條件下培養(yǎng)，日夜溫度分別為26/20 oC，濕度為70%/85%。在全營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)8 d后，進(jìn)行Cd處理，共設(shè)2個(gè)處理水平： ①CK（完全營(yíng)養(yǎng)液），②25

2.3 樣品處理

取預(yù)培養(yǎng)10 d后的印度芥菜苗，添加25 μmol/L Cd處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。Cd處理14 d后，切下植株的成熟葉片，用液氮固定，利用包埋劑包埋好后，在

Symbolm@@ 30 ℃的環(huán)境下利用冷凍切片機(jī)制成切片（60 μm厚）。 在30 ℃條件下冷凍干燥3 d。取出干燥后的樣品，在顯微鏡下拍照。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)標(biāo)元素

為了補(bǔ)償激光剝蝕進(jìn)樣量不均勻?qū)π盘?hào)強(qiáng)度的影響，選擇13C作為內(nèi)標(biāo)元素，對(duì)各元素強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。在生物基體樣品中，不同組織結(jié)構(gòu)13C含量具有一定差異，本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品13C監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，信號(hào)波動(dòng)RSD值僅為4.1%，其在不同組織結(jié)構(gòu)中含量基本一致，不會(huì)對(duì)結(jié)論造成影響。

3.2 鎘與其它元素在莖中的分布

為獲得印度芥菜莖中元素分布的二維圖像，整個(gè)莖樣品置于激光剝蝕樣品池內(nèi)，激光束掃描后，信號(hào)被輸送到ICP MS中檢測(cè)。各元素強(qiáng)度經(jīng)軟件處理并成像。積累型印度芥菜莖中7種元素分布如圖1所示，紅色表示元素的含量高，而紫色則表示含量較低。

由圖1可見(jiàn)，各元素在莖中有不同的分布特點(diǎn)。在植物莖組織切片中，幾乎所有元素在維管組織及其周?chē)?xì)胞中分布較高，Cd大量積聚于由韌皮部與木質(zhì)部組成的維管組織中，在表皮與皮層中Cd濃度也較高，但在由大量薄壁細(xì)胞組成的中間薄壁組織中分布較少，其它元素則與Cd分布特征相似。對(duì)比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在莖內(nèi)部的薄壁細(xì)胞中也有一定程度的分布，但K的含量要遠(yuǎn)高于其它元素，這表明K有很強(qiáng)的木質(zhì)部運(yùn)輸和卸載的能力，與目前普遍認(rèn)為的K 是植物體移動(dòng)能力很強(qiáng)的大量元素這一觀點(diǎn)一致。

3.3 元素分布的相關(guān)性分析

莖中相關(guān)性結(jié)果分析表明，Cd與P， S， K， Ca強(qiáng)度分布呈正相關(guān)（R2>0.3，樣品數(shù)n=5400， 圖2），而K與Ca 呈顯著正相關(guān)（r2=0.75，樣品數(shù)n=5400，圖2c），P和S呈顯著正相關(guān)（R2=0.5323，樣品數(shù)n=5400， 圖3）。Cd與Ca具有相似的分布規(guī)律，可能與二者離子半徑相近、化學(xué)性質(zhì)相似有關(guān)。而K， Ca， P和S的分布呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明重金屬元素進(jìn)入植株體內(nèi)并被其吸收運(yùn)輸過(guò)程是伴隨著植物對(duì)其它元素的吸收。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用LA ICP MS質(zhì)譜技術(shù)原位分析了富集型印度芥菜莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情況，通過(guò)定量分析軟件和二維成像軟件得到Cd等元素在細(xì)胞組織中的二維分布圖像，建立了LA ICP MS定量分析植物細(xì)胞中元素分布的微區(qū)二維成像方法。雙聚焦高分辨ICP MS與LA聯(lián)用技術(shù)具有分辨率高、可多元素且可選擇不同同位素同時(shí)測(cè)定、可實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)，是研究植物組織中元素微區(qū)分布的強(qiáng)有力成像技術(shù)，在植物毒理學(xué)研究方面具有很大的潛力[17]。

要解除過(guò)量重金屬對(duì)植物可能的毒害，植物需要在細(xì)胞中找到一個(gè)合適的地方將其固定下來(lái)并永久儲(chǔ)存[18]。本研究表明，Cd優(yōu)先儲(chǔ)存在由韌皮部與木質(zhì)部組成的維管組織中，維管系統(tǒng)中的重金屬一般被認(rèn)為是與木質(zhì)部運(yùn)輸及其向葉片中的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[19]。在富集型印度芥菜莖中Cd的這種分布形式表明可能有相當(dāng)數(shù)量的Cd主要通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管運(yùn)輸。除此以外，莖的韌皮部細(xì)胞中還分布著大量的Cd，表明可能有相當(dāng)量的Cd可以通過(guò)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)重新在植物組織中分配。另外，在莖的表皮與皮層中Cd濃度也較高，由此可見(jiàn)，葉肉細(xì)胞、莖的表皮在應(yīng)對(duì)累積的重金屬過(guò)程中也同樣發(fā)揮著重要作用。元素分布的相關(guān)性說(shuō)明重金屬元素進(jìn)入植株體內(nèi)并被其吸收運(yùn)輸過(guò)程是伴隨著植物對(duì)其它元素的吸收。

References

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18 Brooks R R.CAB International， New York. 1998： 55-94

19 McNear D H， Peltier E， Everhart J， Chaney R L， Sutton S， Newville M， rivers M， Sparks D L.Environmental Science & Technology， 2005， 39（7）： 2210-2218

由圖1可見(jiàn)，各元素在莖中有不同的分布特點(diǎn)。在植物莖組織切片中，幾乎所有元素在維管組織及其周?chē)?xì)胞中分布較高，Cd大量積聚于由韌皮部與木質(zhì)部組成的維管組織中，在表皮與皮層中Cd濃度也較高，但在由大量薄壁細(xì)胞組成的中間薄壁組織中分布較少，其它元素則與Cd分布特征相似。對(duì)比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在莖內(nèi)部的薄壁細(xì)胞中也有一定程度的分布，但K的含量要遠(yuǎn)高于其它元素，這表明K有很強(qiáng)的木質(zhì)部運(yùn)輸和卸載的能力，與目前普遍認(rèn)為的K 是植物體移動(dòng)能力很強(qiáng)的大量元素這一觀點(diǎn)一致。

3.3 元素分布的相關(guān)性分析

莖中相關(guān)性結(jié)果分析表明，Cd與P， S， K， Ca強(qiáng)度分布呈正相關(guān)（R2>0.3，樣品數(shù)n=5400， 圖2），而K與Ca 呈顯著正相關(guān)（r2=0.75，樣品數(shù)n=5400，圖2c），P和S呈顯著正相關(guān)（R2=0.5323，樣品數(shù)n=5400， 圖3）。Cd與Ca具有相似的分布規(guī)律，可能與二者離子半徑相近、化學(xué)性質(zhì)相似有關(guān)。而K， Ca， P和S的分布呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明重金屬元素進(jìn)入植株體內(nèi)并被其吸收運(yùn)輸過(guò)程是伴隨著植物對(duì)其它元素的吸收。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用LA ICP MS質(zhì)譜技術(shù)原位分析了富集型印度芥菜莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情況，通過(guò)定量分析軟件和二維成像軟件得到Cd等元素在細(xì)胞組織中的二維分布圖像，建立了LA ICP MS定量分析植物細(xì)胞中元素分布的微區(qū)二維成像方法。雙聚焦高分辨ICP MS與LA聯(lián)用技術(shù)具有分辨率高、可多元素且可選擇不同同位素同時(shí)測(cè)定、可實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)，是研究植物組織中元素微區(qū)分布的強(qiáng)有力成像技術(shù)，在植物毒理學(xué)研究方面具有很大的潛力[17]。

要解除過(guò)量重金屬對(duì)植物可能的毒害，植物需要在細(xì)胞中找到一個(gè)合適的地方將其固定下來(lái)并永久儲(chǔ)存[18]。本研究表明，Cd優(yōu)先儲(chǔ)存在由韌皮部與木質(zhì)部組成的維管組織中，維管系統(tǒng)中的重金屬一般被認(rèn)為是與木質(zhì)部運(yùn)輸及其向葉片中的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[19]。在富集型印度芥菜莖中Cd的這種分布形式表明可能有相當(dāng)數(shù)量的Cd主要通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管運(yùn)輸。除此以外，莖的韌皮部細(xì)胞中還分布著大量的Cd，表明可能有相當(dāng)量的Cd可以通過(guò)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)重新在植物組織中分配。另外，在莖的表皮與皮層中Cd濃度也較高，由此可見(jiàn)，葉肉細(xì)胞、莖的表皮在應(yīng)對(duì)累積的重金屬過(guò)程中也同樣發(fā)揮著重要作用。元素分布的相關(guān)性說(shuō)明重金屬元素進(jìn)入植株體內(nèi)并被其吸收運(yùn)輸過(guò)程是伴隨著植物對(duì)其它元素的吸收。

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18 Brooks R R.CAB International， New York. 1998： 55-94

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由圖1可見(jiàn)，各元素在莖中有不同的分布特點(diǎn)。在植物莖組織切片中，幾乎所有元素在維管組織及其周?chē)?xì)胞中分布較高，Cd大量積聚于由韌皮部與木質(zhì)部組成的維管組織中，在表皮與皮層中Cd濃度也較高，但在由大量薄壁細(xì)胞組成的中間薄壁組織中分布較少，其它元素則與Cd分布特征相似。對(duì)比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在莖內(nèi)部的薄壁細(xì)胞中也有一定程度的分布，但K的含量要遠(yuǎn)高于其它元素，這表明K有很強(qiáng)的木質(zhì)部運(yùn)輸和卸載的能力，與目前普遍認(rèn)為的K 是植物體移動(dòng)能力很強(qiáng)的大量元素這一觀點(diǎn)一致。

3.3 元素分布的相關(guān)性分析

莖中相關(guān)性結(jié)果分析表明，Cd與P， S， K， Ca強(qiáng)度分布呈正相關(guān)（R2>0.3，樣品數(shù)n=5400， 圖2），而K與Ca 呈顯著正相關(guān)（r2=0.75，樣品數(shù)n=5400，圖2c），P和S呈顯著正相關(guān)（R2=0.5323，樣品數(shù)n=5400， 圖3）。Cd與Ca具有相似的分布規(guī)律，可能與二者離子半徑相近、化學(xué)性質(zhì)相似有關(guān)。而K， Ca， P和S的分布呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明重金屬元素進(jìn)入植株體內(nèi)并被其吸收運(yùn)輸過(guò)程是伴隨著植物對(duì)其它元素的吸收。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用LA ICP MS質(zhì)譜技術(shù)原位分析了富集型印度芥菜莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情況，通過(guò)定量分析軟件和二維成像軟件得到Cd等元素在細(xì)胞組織中的二維分布圖像，建立了LA ICP MS定量分析植物細(xì)胞中元素分布的微區(qū)二維成像方法。雙聚焦高分辨ICP MS與LA聯(lián)用技術(shù)具有分辨率高、可多元素且可選擇不同同位素同時(shí)測(cè)定、可實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)，是研究植物組織中元素微區(qū)分布的強(qiáng)有力成像技術(shù)，在植物毒理學(xué)研究方面具有很大的潛力[17]。

要解除過(guò)量重金屬對(duì)植物可能的毒害，植物需要在細(xì)胞中找到一個(gè)合適的地方將其固定下來(lái)并永久儲(chǔ)存[18]。本研究表明，Cd優(yōu)先儲(chǔ)存在由韌皮部與木質(zhì)部組成的維管組織中，維管系統(tǒng)中的重金屬一般被認(rèn)為是與木質(zhì)部運(yùn)輸及其向葉片中的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[19]。在富集型印度芥菜莖中Cd的這種分布形式表明可能有相當(dāng)數(shù)量的Cd主要通過(guò)木質(zhì)部導(dǎo)管運(yùn)輸。除此以外，莖的韌皮部細(xì)胞中還分布著大量的Cd，表明可能有相當(dāng)量的Cd可以通過(guò)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)重新在植物組織中分配。另外，在莖的表皮與皮層中Cd濃度也較高，由此可見(jiàn)，葉肉細(xì)胞、莖的表皮在應(yīng)對(duì)累積的重金屬過(guò)程中也同樣發(fā)揮著重要作用。元素分布的相關(guān)性說(shuō)明重金屬元素進(jìn)入植株體內(nèi)并被其吸收運(yùn)輸過(guò)程是伴隨著植物對(duì)其它元素的吸收。

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