河北省石家莊市南部污灌區(qū)厚層包氣帶污染物自然衰減的微生物作用潛力評價

張翠云, 張 勝, 何 澤, 殷密英, 寧 卓

中國地質(zhì)科學院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所, 河北石家莊 050061

污染物的自然衰減存在于任何一個污染場地,是由于天然存在的物理、化學和生物作用, 污染物的濃度或總量不斷地下降。不同污染場地, 自然衰減強度不盡相同, 取決于污染物性質(zhì)和地下環(huán)境條件。自然衰減的有效性評價是污染場地修復方案選擇的基礎(chǔ), 這種評價必須確定微生物作用是否能夠以保護人類健康和環(huán)境的速率正在發(fā)生。微生物含量、分布、活性和多樣性的調(diào)查有助于我們確定這種作用的潛力。

微生物廣泛分布于地下環(huán)境, 包括包氣帶, 包氣帶通常是污染物進入地下水的通道, 包氣帶中的微生物能夠降解或轉(zhuǎn)化污染物為毒性較小的物質(zhì),從而減少污染物進入地下水的通量。在許多農(nóng)業(yè)區(qū),包氣帶厚度可達幾十米。以往的大部分微生物研究主要集中在淺部土壤層或者是下部含水層(Kle?ka et al., 1990; Ludvigsen et al., 1999; Tate, 2000;Chapelle, 2001; Fierera et al., 2003; 張勝等, 2003;齊永強等, 2003), 很少研究地下水面以上的厚層包氣帶。

本文的研究目的是利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)和現(xiàn)代的磷脂脂肪酸(Phosphor Lipid Fatty Acid, PLFA)技術(shù)、Biolog技術(shù)、16 S rRNA基因變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)和測序技術(shù), 調(diào)查石家莊市南部污灌區(qū)厚近30 m包氣帶微生物含量、分布、活性和多樣性, 獲得厚層包氣帶生物自然衰減評價所需的綜合的微生物信息, 評價厚層包氣帶污染物自然衰減的微生物作用潛力。

1 場地概況

圖1 取樣點位置示意圖Fig.1 Sketch map showing sampling sites

取樣場地(N37?58’34", E114?31’46")位于石家莊市南部污灌區(qū)(圖 1)。污水灌溉始于 1958年, 污水水源來自石家莊市排放未經(jīng)處理的污水, 由城市生活污水和工業(yè)廢水組成。污灌作物主要是冬小麥和夏玉米。污灌區(qū)主要分布在排污渠兩側(cè)0.5 km到2 km范圍內(nèi)。年降雨量480 mm, 集中在6—9月, 年蒸發(fā)量1972 mm。

所在地區(qū)屬太行山東麓山前傾斜平原的南部,由滹沱河沖洪積扇南緣、槐沙河洪積沖積扇的北部及其扇間洼地所組成?；诪榧街修窒? 自第四紀以來, 沉積了巨厚沉積物。地下水主要賦存在第四系松散沉積物中。由于周邊超量開采地下水, 地下水位持續(xù)下降, 包氣帶厚度不斷增加, 由20世紀60年代2～3 m, 增加到近年約30 m, 巖性主要是亞粘土, 砂和粘土。

2 樣品采集與分析

2009年5月, 在污灌區(qū)麥地鉆探采集厚層包氣帶剖面土樣。取樣深度1 m以上為5 cm、20 cm、50 cm和100 cm; 1～10 m取樣間隔0.5 m, 10 m以下取樣間隔 2 m, 終孔深度 28.8 m, 采集樣品 27組,用于物理(含水量、粒度分析)、化學(溶解有機碳、NO3–、Cl–和 SO42–)、可培養(yǎng)微生物、PLFA、Biolog和16 S rRNA基因DGGE分析和測序。化學樣品采樣方法由上海澳實分析檢測有限公司提供的采樣瓶、采樣說明、保溫箱進行采樣和保存。除了物理分析樣品外, 其余樣品均現(xiàn)場保溫箱低溫保存, 快速送回實驗室后, PLFA分析樣品–80℃冰箱保存,可培養(yǎng)微生物和Biolog分析樣品4℃冰箱保存。

含水量測試采用稱重法, 100～105℃, 烘干8 h。土樣NO3–含量分析, 10 g濕土溶于50 mL去離子水中, 震蕩15 min, 靜置30 min, 6000 rps離心10 min,取上清液采用紫外分光光度法測試(Pansu et al.,2006)。土樣中的 Cl–、SO42–和溶解有機碳 DOC(Dissolved Organic Carbon)由上海澳實分析檢測有限公司分析, 顆粒分析由中國地質(zhì)科學院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所分析測試中心完成。

可培養(yǎng)微生物分析項目包括細菌總數(shù)TNB(total number of bacteria)、腐生厭氧菌總數(shù)SAB(saprophytic anaerobic bacteria)、亞硝化菌NB1(nitrosobacteria)、硝化菌 NB2(nitrobacteria)、反硝化菌DB(denitrifying bacteria)、鐵氧化菌IOB(iron oxidizing bacteria)、硫酸鹽還原菌 SRB(sulfate reducing bacteria)和產(chǎn)甲烷菌 MB(methanogenic bac-teria)等8項, 其中TNB和SAB采用平板計數(shù)法, 結(jié)果以每克干土菌落形成單位 CFU(colony-forming units)表示; 其余采用液體稀釋法, 結(jié)果以每克干土最大或然數(shù) MPN(most probable number)表示(陳紹銘等, 1985; 許光輝等, 1986; 中國科學院南京土壤研究所微生物室, 1985; 焦瑞身等, 1990; 魯如坤,2000)。SAB在充有氮氣的真空手套箱中室溫(22～28℃)培養(yǎng), 其余在生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)時間: TNB 48 h, SAB 10 d, NB1和NB2 14 d, DB 14 d, IOB 10 d, SRB 21 d, MB 30 d。

土樣總 DNA根據(jù) Zhou等(1996)的方法提取,采用試劑盒Mobio Power Clean DNA clean-up kit進行DNA純化。16 S rRNA基因擴增引物為通用引物F357GC (5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG -3’) 和 R518(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)。PCR的反應(yīng)條件為: 預變性條件為 94℃ 2 min, 前 20個循環(huán)為 94℃ 1 min,65～55℃ 50 s和72℃ 30 s (其中每個循環(huán)后復性溫度下降 0.5℃), 后 10個循環(huán)為 94℃ 1 min, 55℃50 s 和 72℃ 30 s, 最后在 72℃下延伸 5 min。DGGE、PLFA、Biolog分析在中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心進行, DGGE條帶切割純化克隆后送北京華大基因公司測序。

3 結(jié)果

3.1 物理化學特征

顆粒大小、含水量、DOC、NO3–、SO42–和 Cl–在包氣帶剖面不同深度的含量分布如圖2所示。剖面粉砂和砂的平均含量各為 42%左右, 粘土含量較低, 平均 14%。地層結(jié)構(gòu)主要是亞粘土層, 夾少量砂層和粘土層, 4.5—5.5 m層段為一明顯的砂層,12.5 m深處為一明顯的重粘土層, 剖面底部為亞砂土質(zhì)砂層, 其余主要為亞粘土層。含水量在淺部5 cm和20 cm處含量較高, 均為24%, 但在砂層含量很低, 為 5%, 接近地下水位處含量最高, 為29%。DOC在表層5 cm 和20 cm處含量較高, 分別為78 mg/kg和60 mg/kg, 而在下伏包氣帶含量很低, 變化在14～36 mg/kg之間, 但是在22 m深處出現(xiàn)一峰值, 為103 mg/kg, 取樣時發(fā)現(xiàn)此層位有黑色的泥炭層。NO3–含量在淺表 5 cm 處較高, 為72.1 mg/kg, 其下含量隨巖性而變化, 在砂層含量低, 變化在 13～23 mg/kg, 但是在重粘土層上方的亞粘土層出現(xiàn)一峰值, 為142.10 mg/kg。SO42–在淺表5 cm含量最高, 為226 mg/kg, 其下含量隨巖性而變化, 在砂層含量低, 小于 29 mg/kg, 在粘土層出現(xiàn)峰值, 為 179 mg/kg; Cl–與 NO3–、SO42–分布不盡相同, 在淺表含量低, 5 cm 和 20 cm 處分別為59 mg/kg和 64 mg/kg, 但是其下也隨巖性而變化,在砂層含量低, 為 16～41 mg/kg, 在粘土含量較高的 0.8 m和 12.5 m處分別出現(xiàn)峰值, 分別為108 mg/kg和109 mg/kg。

3.2 可培養(yǎng)微生物分布特征

利用可培養(yǎng)方法檢測的TNB、SAB、NB1、NB2、DB、IOB、SRB和MB含量在厚層包氣帶沉積物中的分布如圖3所示。

培養(yǎng)法獲得的TNB變化在104～106CFU/g dw之間, SAB變化在102～107CFU/g dw之間, NB1含量變化于 0～106MPN/g dw之間, NB2含量變化于 0～106MPN/g dw 之間, DB 含量變化于 103～107MPN /g dw之間, IOB含量變化 于 0～106MPN /g dw 之 間, SRB 含 量 變化 于 0～102MPN /g dw 之 間, MB 含 量 變化于0～102MPN /g dw之間。

圖2 厚層包氣帶不同深度沉積物物理和化學含量分布Fig.2 Distribution of concentrations of physical and chemical compositions from sediments of different depths in the thick vadose zone

圖3 厚層包氣帶不同深度沉積物可培養(yǎng)微生物含量分布Fig.3 Distribution of content of cultivable bacteria from sediments of different depths in the thick vadose zone

TNB在厚層包氣帶剖面的分布特征是, 在淺表土壤層 5 cm至 50 cm層段含量很高, 達到n×106CFU/g dw; 在砂層段4.5～5.5 m含量最低, 為n×103～ n×105CFU /g dw; 在砂層下部亞粘土層, 含量又增加到n×105CFU/g dw, 但是在12.5 m重粘土層, 含量下降到n×104CFU/g dw; 在DOC含量增大的22 m處及其附近, 含量又增加到n×105CFU/g dw;到最下部亞砂土質(zhì)砂層含量又降低到n×104CFU/g dw。SAB, 總體來說, 較細菌總數(shù)低1～2個數(shù)量級, 在 5 cm和 20 cm處含量較低, 為n×104～ n×105CFU/g dw, 但是在0.5 m和0.8 m處,出現(xiàn)峰值, 達到 n×106CFU/g dw, 在砂層含量也較低, 為n×103CFU/g dw; 在重粘土層及其以下層位含量更低, 大部分為n×102CFU/g dw。

NB1在淺表土壤層 5 cm處含量最高, 為1.7×106MPN/g dw, 其下至 10.5 m 層段大部分為n×103MPN/g dw, 再往下含量很低, 大部分<10 MPN/g dw。NB2在淺表土壤層5 cm和20 cm處含量較低, 為n×104MPN/g dw, 但是在0.5 m和0.8 m處, 出現(xiàn)峰值, 達到n×106MPN /g dw, 在1 m至7.5 m層段, 除了個別深度出現(xiàn)n×102MPN /g dw外, 大部分深度含量<60 MPN /g dw; 7.5 m以下層段含量大部分為0。

DB在整個剖面均有分布, 與TNB分布相似。在 5 cm 和 20 cm 處 含 量 較 高, 分 別 為1.4×106MPN/g dw 和 2.0×107MPN/g dw; 在砂層含量較低, 為n×103～ n×105MPN/g dw; 其下大部分為n×104MPN/g dw。IOB在淺表0.8 m以上含量較高,為n×104～ n×105MPN/g dw; 在 0.8 m至4 m層段,含 量 為 n×104MPN/g dw; 在 砂 層 為 0～n×103MPN/g dw; 其 下 大 部 分 為 n×102～n×103MPN/g dw。SRB在淺表5 cm處含量最大, 為3.1×102MPN/g dw, 其下大部分<10 MPN/g dw。淺表 5 cm和 20 cm處含有少量 MB, 分別為24.8 MPN/g dw和9.4 MPN/g dw, 其下大部分為0,但是在 22 m 處上下層位出現(xiàn)峰值, 均為1.3×102MPN/g dw, 峰值下含量也較高, 為29.7～58 MPN/g dw。

3.3 生物量和活性分布特征

磷脂脂肪酸PLFA (Phosphor Lipid Fatty Acid)是活體細胞膜的主要成分, 周轉(zhuǎn)速率極快且隨細胞死亡而迅速降解, 是生物標記物之一。PLFA含量越高, 生物量越高。厚層包氣帶剖面13個不同深度土樣, 包括淺表土壤層、砂層和下部粘土層附近樣品,進行了PLFA分析。結(jié)果顯示, PLFA含量在淺表土壤層5 cm處最高, 為51.359 nmole/g dw, 在砂層含量極低, 為0.249 nmole/g dw, 在下伏高DOC含量層位附近PLFA含量又增加(圖4A)。 據(jù)估計, 1 nmol PLFA 相當于 2.0×107個細菌(Balkwill et al., 1988)。厚層包氣帶剖面 PLFA含量變化在 0.249～51.359 nmol/g dw之間, 據(jù)此估計的細菌數(shù)為5.0×106～1.0×109cells/g dw, 該值較平板計數(shù)獲得的TNB高3個數(shù)量級。此外, 代表厭氧菌的PLFA生物標記cy17:0和cy19:0僅在土壤層50 cm以淺有分布, 前者在 5 cm、20 cm和 50 cm處分別為 1.61 nmol/g dw、0.68 nmol/g dw 和0.24 nmol/g dw; 后者分別為 0.74 nmol/g dw、0.26 nmol/g dw和0。50 cm以下包氣帶兩者均未檢出。

圖4 厚層包氣帶不同深度沉積物PLFA(A)和Biolog (B)分析結(jié)果Fig.4 Results of Phosphor Lipid Fatty Acid (PLFA) (A) and Biolog (B) analysis of sediments from different depths in the thick vadose zone

Biolog ECO微孔板設(shè)計了3個重復的31種不同的碳源, 平均吸光值 AWCD(Average Well Color Development)(無量綱)反映了微生物對不同碳源的利用情況和利用程度, AWCD值越大, 微生物對碳源利用的能力越大, 樣品的微生物活性越高。厚層包氣帶剖面13個不同深度土樣的Biolog分析結(jié)果顯示(圖4B), 培養(yǎng)10 d后, AWCD值在淺表土壤層5 cm和20 cm處很高, 分別為0.90和0.93; 在砂層較小, 為0.32; 但是最小值出現(xiàn)在12.5 m粘土層上伏層, 為 0.057; 在包氣帶下部, 特別是在 DOC含量高層位附近AWCD值增大, 為0.72。AWCD值在剖面上的分布類型與PLFA和平板計數(shù)分布類型基本一致。

3.4 微生物群落多樣性分布特征

對厚層包氣帶剖面不同深度土樣進行總 DNA提取, 16 S rRNA基因片段PCR擴增和DGGE分析,得到如圖5所示的DGGE圖譜。DGGE圖譜顯示的條帶是優(yōu)勢菌群, 每一條帶代表一類細菌, 條帶亮度越亮, 該菌含量越高。根據(jù)每一泳道的條帶數(shù),可知剖面不同深度微生物多樣性?？傮w來說, 砂層以上包氣帶菌種類型較下部多, 在1.5 m到3.5 m層段菌種類型最多, 為17～21種; 在砂層為10～18種,在下部18～27 m, 除了DOC含量高的層段為14外,菌種類型很少, 為6～9種。對整個剖面53條明顯條帶切膠回收純化克隆測序, 并將測序結(jié)果與已知GenBank數(shù)據(jù)庫比對。結(jié)果顯示, 厚層包氣帶剖面優(yōu)勢菌群主要是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和一些目前還沒有確定種類歸屬的類群(unclassified group)。變形菌門中α-變形菌最豐富。識別出19種已知菌, 如Acinetobactersp.(不動桿菌), Activated sludge bacterium GC_R2A_S_19(GC_R2A_S_19活性污泥菌株),Acinetobacter junii strain(瓊氏不動桿菌),Boseasp.(包西氏菌),Comamonadaceae bacterium(叢毛單胞菌),Rumen bacterium(瘤胃菌),Bradyrhizobiaceae bacterium(慢性根瘤菌),Zoogloeasp.(動膠菌),Sinorhizobium meliloti(苜蓿中華根瘤菌),Herbaspirillumsp.(草螺菌),Hydrogenophagasp.(噬氫菌),Bacillus licheniformis strain(地衣芽孢桿菌)等。33種未培養(yǎng)菌, 其中4個條帶序列相似性小于等于96%, 為疑似新種, 未培養(yǎng)菌群占細菌總數(shù)的 63%,說明剖面大部分細菌是不可培養(yǎng)的。

4 討論

4.1 微生物含量、活性和多樣性隨深度變化的機制分析

微生物含量、活性和多樣性在土壤層(5～20 cm)均較高, 在其下伏包氣帶較低, 這種現(xiàn)象在其它地區(qū)的包氣帶剖面也有報導(Balkwill et al., 1988;Kieft et al., 1998; Blume et al., 2002)。原因是土壤層營養(yǎng)豐富, 而下伏包氣帶營養(yǎng)銳減, 特別是DOC含量聚減。

圖5 厚層包氣帶不同深度沉積物16 S rRNA基因DGGE圖譜Fig.5 16 S rRNA gene denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) banding patterns for sediments from different depths in the thick vadose zone

下伏包氣帶微生物含量、活性和多樣性還隨巖性而變化。在亞粘土層含量、活性和多樣性較高, 而在4.5～5.5 m的砂層和12.5 m的重粘土層含量、活性和多樣性均較低。砂層粒間孔隙大, 水分、營養(yǎng)易流失, 從而影響微生物生長。剖面含水量、DOC、NO3–、SO42–和 Cl–在砂層含量均低的分析結(jié)果(圖 2)得到證實。另外, 砂層孔隙大, 有利于微生物隨水流向下運移, 也是砂層微生物含量、活性和多樣性低的一個原因。砂層下緊鄰的亞粘土層(7.5 m深處)營養(yǎng)和微生物含量、活性和多樣性較高, 可能受到砂層的營養(yǎng)和微生物向下運移補給的影響。重粘土層中粒徑小于0.2 μm的顆粒占45%, 粘土孔喉直徑<0.2 μm, 而大部分微生物個體>0.2 μm, 導致微生物不能棲息其中和運移, 這是12.5m處重粘土層微生物含量、活性和多樣性低的主要原因。重粘土層含水量較高(22.3%), SO42–和 Cl–含量出現(xiàn)峰值(分別為 179 mg/kg和 109 mg/kg), DOC含量較低(22 mg/kg), NO3–含量峰值(142.1 mg/kg)不是出現(xiàn)在重粘土層, 而是出現(xiàn)在其上的亞粘土層, 反映的是重粘土層本身化學組分特點, 以及重粘土層具有阻截上部包氣帶淋溶NO3–的作用。亞粘土孔隙大小介于砂巖和粘土之間, 有利于水分和營養(yǎng)的傳輸和微生物滯留, 因而亞粘土層微生物含量、活性和多樣性較高。巖性影響微生物含量、活性和多樣性的現(xiàn)象在其它地區(qū)也有報導(Chau et al., 2011)。

下伏包氣帶22 m層位及其附近微生物含量、活性和多樣性增加, 取樣時觀察到該層位含有泥炭層, DOC在該層位出現(xiàn)峰值。古土壤有機質(zhì)豐富,有利于微生物生長繁殖, 這種現(xiàn)象在其它古土壤也出現(xiàn)(Brockman et al., 1992)。

TNB、SAB、DB和IOB在整個厚層包氣帶剖面均有分布, 而NB1、NB2、SRB和MB僅在包氣帶上部或土壤層有分布, 而下部包氣帶很少或沒有。NB1和NB2的分布主要是受NH4+的分布控制,灌溉的污水含有較多的 NH4+(65 mg/L)(張翠云等,2012), 但是NH4+易被粘土吸附, 不易向下遷移, 導致NB1和NB2分布在包氣帶上部。SRB和MB需在強還原環(huán)境下生長繁殖, 其分布主要受氧化還原條件的控制。間歇性的污水漫灌, 導致土壤層呈淹水與落水交替性地轉(zhuǎn)換, 淹水時土壤層豐富的有機質(zhì)有利于還原環(huán)境的形成, 而下伏包氣帶有機質(zhì)有限, 不利于還原環(huán)境的形成, 因此, SRB和MB僅分布在土壤層, 而下伏包氣帶很少或沒有。PLFA的分析也得到證明, 代表厭氧菌的 PLFA生物標記cy17:0和cy19:0僅在土壤層50 cm以淺有分布, 下部包氣帶均未檢出。

SAB檢測的細菌包括專性厭氧菌和兼性厭氧菌, 而且在整個包氣帶剖面均有分布, 但是從 SRB和MB在剖面的分布來看, 檢測的SAB應(yīng)該主要是兼性厭氧菌, 專性厭氧菌僅在土壤層有分布。

4.2 剖面生物自然衰減潛力分析

灌溉的污水含有各種污染物, 包括有機污染物、重金屬和含氮化合物。從各種菌在剖面的含量、分布、活性和多樣性來看, 土壤層(5～20 cm)生物自然衰減潛力最大。有機污染物可作為異養(yǎng)菌的碳源和能源, 通過微生物的呼吸作用使有機污染物降解,有機污染物可被一系列微生物利用, 除了好氧異養(yǎng)菌和兼性厭氧異養(yǎng)菌外, 還可被專性厭氧異養(yǎng)菌硫酸鹽還原菌和產(chǎn)甲烷菌降解。重金屬的自然衰減作用主要是吸附和沉淀作用, 但是微生物作用可促進這兩種作用, 存在于土壤層的硫酸鹽還原菌可使金屬呈硫化物而沉淀, 從而阻止重金屬向下運移。吸附和硝化作用是NH4+的主要自然衰減作用, NH4+被吸附后硝化, 使得硝化作用主要發(fā)生在包氣帶上部,特別是土壤層。

土壤層下伏包氣帶微生物含量、活性和多樣性均減少或降低, 主要是好氧異養(yǎng)菌和兼性厭氧異養(yǎng)菌以及好氧自養(yǎng)菌, 其生物自然衰減的潛力不及土壤層, 但是仍然具有生物自然衰減潛力, 特別是在包氣帶下部 DOC含量高的層位, 其微生物活性在下伏包氣帶最大, 生物自然衰減潛力增大。

反硝化作用是NO3–生物自然衰減的主要作用。反硝化菌在整個剖面均有分布, 且含量很高。但是反硝化作用在剖面是否發(fā)生, 除了存在反硝化菌外,還必須具備還原環(huán)境(Korom, 1992)。從專性厭氧菌硫酸鹽還原菌和產(chǎn)甲烷菌的分布來看, 下伏包氣帶主要是氧化環(huán)境, 不具備反硝化作用發(fā)生的還原條件。另外, 從氮同位素分析結(jié)果來看, NO3–-δ15N變幅很小, 指示沒有或很少反硝化作用的發(fā)生(Zhang et al., 2013)。然而, 厚層包氣帶存在很高含量的反硝化菌, 指示厚層包氣帶具有原位刺激該菌生長和活性的潛力。

5 結(jié)論

1)傳統(tǒng)和現(xiàn)代的微生物檢測方法揭示污灌區(qū)厚層包氣帶微生物分布特征是, 土壤層微生物含量高,活性高, 代謝類型多, 異氧菌與自養(yǎng)菌、好氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌并存在; 下伏包氣帶微生物含量減少, 活性降低, 代謝類型減少, 主要是好氧異養(yǎng)菌和兼性厭氧菌以及好氧自養(yǎng)菌, 且受巖性控制, 在砂層和重粘土層含量低, 活性低, 在亞粘土層含量較高, 活性較高。

2)DGGE分析和測序揭示, 污灌區(qū)厚層包氣帶不同深度微生物多樣性不盡相同, 包氣帶上部菌種類型較多, 下部相對較少; 剖面53個條帶切膠測序比對結(jié)果顯示, 優(yōu)勢菌群主要是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和一些目前還沒有確定種類歸屬的類群(unclassified group), 其中33種不可培養(yǎng)菌, 占細菌種類的 63%, 證實剖面大部分細菌是不可培養(yǎng)的。

3)污灌區(qū)土壤層(5～20 cm)具有很高的生物自然衰減潛力, 而且下伏包氣帶仍然具有生物自然衰減潛力, 特別是下部 DOC含量高的層位生物自然衰減潛力更大。

致謝:研究過程中, 得到了中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心呼慶博士在分子生物學實驗方面的指導。特此致謝。

陳紹銘, 鄭福壽.1985.水生微生物學實驗法[M].北京: 海洋出版社: 85-91.

焦瑞身, 周德慶.1990.微生物生理代謝實驗技術(shù)[M].北京: 科學出版社: 132.

魯如坤.2000.土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社.

齊永強, 王紅旗, 劉敬奇.2003.土壤石油微生物降解影響因子的正交實驗分析[J].地球?qū)W報, 24(3): 279-284.

許光輝, 鄭洪元.1986.土壤微生物分析方法手冊[M].北京: 農(nóng)業(yè)出版社: 103-135.

張翠云, 張勝, 馬琳娜, 殷密英.2012.污灌區(qū)地下水硝酸鹽污染來源的氮同位素示蹤[J].地球科學—中國地質(zhì)大學學報,37(2): 350-356.

張勝, 張翠云, 葉思源.2003.土壤包氣帶土體無機氮的吸附與微生物作用影響試驗方法[J].地球?qū)W報, 24(2): 187-192.

中國科學院南京土壤研究所微生物室.1985.土壤微生物研究法[M].北京: 科學出版社: 45-46.

BALKWILL D L, LEACH F R, WILSON J T, MCNABB J F,WHITE D C.1988.Equivalence of microbial biomass measures based on membrane lipid and cell wall components,adenosine triphosphate, and direct counts in subsurface sediments[J].Microbial Ecology, 16: 73-84.

BLUME E, BISCHOFF M, REICHERT J M, MOORMAN T,KONOPKA A, TURCO R F.2002.Surface and subsurface microbial biomass, community structure and metabolic activity as a function of soil depth and season[J].Applied Soil Ecology, 20: 171-181.

BROCKMAN F J, KIEFT T L, FREDRICKSON J K,BJORNSTAD B N, LI S W, SPANGENBURG W, LONG P E.1992.Microbiology of Vadose Zone Paleosols in South-Central Washington State[J].Microbial Ecology, 23:279-301

CHAPELLE F H.2001.Ground-water microbiology and geochemistry[M].2nd ed.New York: John Wiley ＆ Sons Inc.

CHAU J F, BAGTZOGLOU A C, WILLIG M R.2011.The Effect of Soil Texture on Richness and Diversity of Bacterial Communities[J].Environmental Forensics, 12: 333-341

CHEN Shao-ming, ZHENG Fu-shou.1985.Experimental methods for aquatic microbiology[M].Beijing: Ocean Press(in Chinese).

FIERERA N, SCHIMEL J P, HOLDEN P A.2003.Variation in microbial community composition through two soil depth profiles[J].Soil Biology ＆ Biochemistry, 35: 167-176.

Institute of Soil Science, C.A.S.1985.Methods for studying soil microbiology[M].Beijing: Science Press(in Chinese).

JIAO Rui-shen, ZHOU De-qing.1990.Experimental techniques of microbial physiological metabolism[M].Beijing: Science Press(in Chinese).

KIEFT T L, MURPHY E M, HALDEMAN D L, AMY P S,BJORNSTADT B N, MCDONALD E V, RINGELBERG D B,WHITE D C, STAIR J O, GRIFFITHS R P, GSELL T C,HOLBEN W E, BOONE D R.1998.Microbial transport, survival, and succession in a sequence of buried sediments[J].Microbial Ecology, 36:336-348.

KLE?KA G M, DAVIS J W, GRAY D R, MADSEN S S.1990.Natural bioremediation of organic contaminants in groundwater: Cliffs-Dow Superfund Site[J].Groundwater, 28(4):534-543.

KOROM S F.1992.Natural denitrification in the saturated zone: a review[J].Water Resources Reseach, 28(6): 1657-1668.

LU Ru-kun.2000.Methods of Soil Analysis for Agricultural Chemicals.Beijing: China Agricultural Science and Technology Press(in Chinese)

LUDVIGSEN L, ALBRECHTSEN H J, RINGELBERG D B,EKELUND F, CHRISTENSEN T H.1999.Distribution and Composition of Microbial Populations in a Landfill Leachate Contaminated Aquifer (Grindsted, Denmark)[J].Microbial Ecology, 37: 197-207.

PANSU M, GAUTHEYROU J.2006.Handbook of Soil Analysis:Mineralogical, Organic and Inorganic Methods[M].Berlin,New York: Springer.

QI Yong-qiang, WANG Hong-qi, LIU Jing-qi.2003.Impact of Several Factors on the Bioremediation of Oil in Soil[J].Acta Geoscientia Sinica, 24(3): 279-284(in Chinese with English abstract)

TATE R L.2000.Soil microbiology.2nd ed[M].New York: John Wiley and Sons.

XU Guang-hui, ZHENG Hong-yuan.1986.Manual of analytical methods of soil microbiology[M].Beijing: Agriculture Press(in Chinese).

ZHANG Cui-yun, ZHANG Sheng, MA Lin-na, YIN Mi-ying.2012.Nitrogen isotope tracing of sources of nitrate contamination of groundwater from wastewater irrigated area[J].Earth Science-Journal of China University of Gescience, 37(2):350-356.

ZHANG Cui-yun, ZHANG Sheng, YIN Mi-ying, MA Lin-na, HE Ze, NING Zhuo.2013.Nitrogen isotope studies of nitrate contamination of the thick vadose zones in the wastewater-irrigated area[J].Environmental Earth Sciences, 68(5):1475-1483

ZHANG Sheng, ZHANG Cui-yun, YE Si-yuan.2003.The Experimental Methodological Research on the Adsorption of Inorganic Nitrogen and the Effect of Microbe Action in the Soil of Unsaturated Zone[J].Acta Geoscientia Sinica, 24(2):187-192(in Chinese with English abstract)

ZHOU J Z, BRUNS M A, TIEDJE J M.1996.DNA recovery from soils of diverse composition[J].Applied and Environmental Microbiology, 62 (2): 316-322.