頂空氣相色譜法檢驗血液中乙醇含量

張瀅 劉陽

(1.齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾市公安局,黑龍江齊齊哈爾 161005)

頂空氣相色譜法檢驗血液中乙醇含量

張瀅1劉陽2

(1.齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾市公安局,黑龍江齊齊哈爾 161005)

本文采用頂空進樣方法,通過改進色譜條件,改進數(shù)據(jù)處理方式,從而建立一個改進的血液中乙醇的檢驗方法,以獲得更好的分離效果和線性關(guān)系,解決實際應(yīng)用中存在的同一個樣品無法重復(fù)進樣,標(biāo)樣存儲和取用的問題。

內(nèi)標(biāo)曲線法 頂空氣相色譜 血液中乙醇 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

Headspace sample injection method with improved chromatographic condition and data processing was used in this article, establish an improved detection of alcoholicity in blood, thereby to get a better separation effect and linear relationship. The matter of the same sample can’t be injected repetition, and the matter of samples’ store and access have been solved.

internal standard curve method; headspace gas chromatography alcohol in blood relative standard deviation

乙醇廣泛存在于日常飲用的各種飲品中,可以說是涉及人數(shù)最多、應(yīng)用范圍最廣、濫用程度最高的一種毒(藥)物。長期過量飲酒或慢性酒精中毒可誘發(fā)或?qū)е滦哪X血管疾病、消化系統(tǒng)疾病、精神障礙等多種疾病,甚至導(dǎo)致死亡。飲酒后人的中樞神經(jīng)活動會變得遲鈍,致使手足活動遲緩、生理機能減退、視力聽力等感知能力降低,還會導(dǎo)致行為異常,從而發(fā)生意外甚至犯罪,比如車禍、吸入嘔吐物窒息而死、酒后肇事等[1]。酒后駕駛更是一直以來困擾我們的世界性的社會問題,是造成交通肇事的主要原因[2]。血液中乙醇含量(blood alcohol concentration,BAC)的檢驗在判定飲酒后駕車、飲酒后違法犯罪、飲酒中毒死亡等案事件中起到十分重要的作用。

現(xiàn)階段對于血中乙醇含量的檢測方法主要有化學(xué)法、光譜法、電池法、酶學(xué)法和氣相色譜法[3,4]。其中頂空氣相色譜法(HS/GC)具有分離效率高、檢測靈敏度高、分析速度快、準(zhǔn)確度較高、精密度高、雜質(zhì)干擾少等諸多優(yōu)點[5、6],因而在BAC的測定中得到廣泛應(yīng)用。但是在實際應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn),實驗過程往往受到同一個樣品無法重復(fù)進樣的問題,標(biāo)樣的儲存和取用問題的困擾。因此,本文著重從上述三個問題入手,力爭可以解決實際操作過程中遇到的這些問題。

圖1 乙醇、叔丁醇的氣相色譜圖

圖2 校正曲線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

藥品試劑:無水乙醇(Sigma-aldrich,色譜純),叔丁醇(Fluka,色譜純)。

儀器設(shè)備:頂空進樣器(Agilent 7894E Headspace Sampler);氣相色譜儀(Agilent 6890N GC),GILSON活塞排代式移液器(M1000型),GILSON空氣排代式移液器(P100型)。

1.2 實驗步驟

(1)樣品處理:將無水乙醇標(biāo)準(zhǔn)品配制成10mg/mL的標(biāo)注樣品貯備液,冷藏備用。

配制2.0mg/mL的叔丁醇溶液,作為內(nèi)標(biāo)物,冷藏備用。

精密量取血液樣品500μL,加入10mL頂空瓶,再加入2.0mg/mL的叔丁醇內(nèi)標(biāo)液50μL,壓蓋封口,制成待檢樣品,供HS/GC分析。

(2)進樣器條件:樣品瓶溫度70℃,進樣環(huán)溫度80℃,傳輸線溫度90℃;

(3)色譜條件:色譜柱DB-ALC1 30m×530μm×3.0μm毛細(xì)管柱,柱溫箱100℃(保持8min),載氣N2,流速3.0mL/min;

(4)檢測器條件:火焰光度檢測器(FID),加熱器溫度280℃,氫氣流量40.0mL/min,空氣流量300mL/min。

(5)線性回歸方程:將10mg/mL的乙醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別稀釋成20mg/100mL、40mg/100mL、80mg/100mL、120mg/100mL、200 mg/100mL、300mg/100mL、400mg/100mL等濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個濃度梯度平行5份,加入內(nèi)標(biāo)物溶液,制成樣品進行HS/GC分析。分析所得數(shù)據(jù),按照經(jīng)叔丁醇校正過的乙醇峰面積建立校正表,將校正表保存到色譜方法中,即得內(nèi)標(biāo)曲線-頂空氣相色譜法[7]。

2 實際應(yīng)用中存在的問題

2.1 重復(fù)進樣的問題

在實際應(yīng)用中,時常會發(fā)生由于各種原因而造成檢驗血液量采集不足的情況。通過頂空氣相色譜分析的原理[8]可知,頂空瓶內(nèi)的樣品每進樣一次都會造成濃度的損失,所以不能像直接進樣分析那樣對同一個檢材樣品進行重復(fù)進樣分析。而按照要求卻需要平行取樣和留樣備檢,如果檢材的量不足會給檢驗工作帶來很大的困難。

由此我們考慮到:由于每次的進樣量很少,損失量不多,因此按照亨利定律計算,重復(fù)進樣分析得到的結(jié)果偏差可能不是很大。如果推測成立,則我們雖然不能把通過重復(fù)進樣獲得的數(shù)據(jù)作為檢驗意見的依據(jù),卻至少可以在平行樣品出現(xiàn)數(shù)據(jù)異常時,對其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)[9]進行分析,分辨誤差是來自檢材均勻性、檢材處理還是儀器進樣,在檢材極少時進行這樣的操作就很有實際意義。

2.2 標(biāo)樣存儲的問題

表1 單次進樣與重復(fù)進樣檢驗結(jié)果

表2 冷藏保存一年的標(biāo)準(zhǔn)溶液與新配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗結(jié)果

表3 冷藏的標(biāo)準(zhǔn)溶液與室溫的標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗結(jié)果

進口的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購買困難,且價格昂貴。為了保證檢驗的準(zhǔn)確性我們又需要定期校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線,不斷消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液。所以,如果儲存在3℃條件下的10mg/mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液,能夠長時間儲存而不發(fā)生濃度的變化,就可以緩解標(biāo)液消耗的難題,也為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)存儲相關(guān)的研究提供一些借鑒。

2.3 標(biāo)樣取用的問題

不同溫度下溶液的密度是不同的,那么3℃條件下冷藏備用的叔丁醇內(nèi)標(biāo)液或乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液是直接取出使用,還是放置達到室溫(通常是20℃左右)后再使用就成為本文研究的內(nèi)容之一。

3 結(jié)果與討論

3.1 分離效果和線性關(guān)系

從圖1可知,本文建立的方法因為采用頂空進樣雜質(zhì)干擾少,基線平穩(wěn);不改變柱溫箱溫度即能將乙醇峰和叔丁醇內(nèi)標(biāo)峰很好的分離且峰形良好。恒定溫度還有利于儀器保持平衡,節(jié)約分析時間。

由本文方法求得的線性回歸方程如下:

從圖2可以看出,本文方法的線性關(guān)系良好,既說明了方法的可用性也說明了采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法的準(zhǔn)確性。

3.2 單次進樣與重復(fù)進樣對比分析

我們對低濃度和中等濃度兩個梯度使用同一個樣品重復(fù)進樣3次,與3份平行樣品單次進樣所得數(shù)據(jù)均列于表1。從表1中的各組RSD值可以看出,同一個樣品重復(fù)進樣3次所產(chǎn)生的誤差與3份平行樣品單次進樣之間的誤差并沒有明顯差異,測得的乙醇含量也沒有明顯差別。充分證明重復(fù)進樣的操作可以作為一個有用的輔助手段。

3.3 3℃封存1年的標(biāo)準(zhǔn)液與新配制標(biāo)準(zhǔn)液對比分析

取用一定量用封口膜封存在3℃下1年期的10mg/mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液,分別稀釋為20mg/100mL、200mg/100mL兩個級別的標(biāo)準(zhǔn)溶液,與新配制的同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行對比實驗,實驗數(shù)據(jù)詳見表2。通過對比各組數(shù)據(jù)可以看出,儲存1年的10mg/mL的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液與新配制的溶液相比沒有明顯的差異,含量沒有損失,數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性也好,可以繼續(xù)使用。

3.4 冷藏標(biāo)準(zhǔn)液與常溫標(biāo)準(zhǔn)液對比分析我們分別用冷藏標(biāo)液直接制樣和放置至室溫后制樣的方式,對各自濃度為20mg/100mL、200mg/100mL的兩組樣品進行分析,評價其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),所得數(shù)值詳見表3。通過對比各組數(shù)據(jù)可以看出,冷藏狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和常溫下的相比,不論各物質(zhì)的峰面積、最終的含量還是各自的RSD值都沒有明顯的差異,也沒有明顯的變化規(guī)律,說明溶液濃度沒有發(fā)生明顯變化,因此在日常的檢驗工作中可以將冷藏著的標(biāo)準(zhǔn)溶液取出后直接使用。

4 結(jié)語

本文使用頂空氣相色譜法(HS/GC),結(jié)合工作曲線法和內(nèi)標(biāo)法,既能反應(yīng)方法的靈敏度和線性相關(guān)情況,又能校正儀器、環(huán)境等因素造成的誤差,從而改進了內(nèi)標(biāo)曲線-頂空氣相色譜分析血液中乙醇含量的方法。此方法不僅能提高定量分析的準(zhǔn)確性,還適用于大批量樣品的分析,提高工作效率。運用這一方法對文中提到的幾個問題進行了驗證,得到理想的結(jié)果。

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[2]David P. Phillips & Kimberly M.Brewer.The relationship between serious injury and blood alcohol concentration (BAC) in fatal motor vehicle accidents:BAC=0.01% is associated with significantly more dangerous accidents than BAC = 0.00%[J].Addiction,2011,106:1614-1622.

[3]李瓊,謝國明等.血乙醇濃度分析方法及其評價[J].分析儀器,2005,3:57-59.

[4]趙楚,桑向玲,付文輝.乙腈提取法測定血中乙醇含量[J].廣東公安科技,2001,3(63):22-23.

[5]潘靜.頂空氣相色譜法測定全血中乙醇的含量[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2008,25(6):1088-1089.

[6]劉兆,楊瑞琴等.腐敗血液中乙醇的頂空氣相色譜分析[J].中國司法鑒定,2010,4:26-28.

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