八角蓮中鬼臼毒素的含量測定技術

孫海峰

黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司雞西分公司

八角蓮中鬼臼毒素的含量測定技術

孫海峰

黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司雞西分公司

目的：建立高效液相色譜法測定八角蓮中鬼臼毒素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Diamonsiltm C18柱；流動相：甲醇-0.1mol/L磷酸二氫鉀水溶液（50∶50）；流速：1.0ml/min；檢測波長：290nm。結果：鬼臼毒素在0.04769～0.4769mg/ml呈良好線性關系（r=0.9996），平均回收率為99.94%，RSD=1.71%（n=5）。結論：采用高效液相色譜法測定八角蓮中鬼臼毒素的含量，操作簡便、準確，專屬性強。

八角蓮；鬼臼毒素；含量測定

八角蓮為小檗科植物八角蓮Dysosma versipellis（Hance．）M．cheng（Podophyllum versipelle Hance．）的根及根莖。具有清熱解毒、化痰散結、祛痰消腫之功能。用于癰腫疔瘡、瘰疬、咽喉腫痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等。筆者曾對八角蓮的性狀、顯微結構進行過研究［1］。本實驗采用高效液相色譜法測定八角蓮中鬼臼毒素的含量，為完善八角蓮藥材的質量標準及臨床應用提供科學依據(jù)。

1、儀器與試藥

1.1 儀器

戴安UltiMateTM3000型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、變色龍（chromeleon）軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；島津AUW120D分析天平（d＝0．1mg/0．01mg）；UP5200H超聲波清洗器（熊貓集團南京 電子 計量有限公司）。

1.2 試藥

甲醇為色譜純（中國上海陸都化學試劑廠）；磷酸二氫鉀為分析純。鬼臼毒素對照品（含量測定用，以93．5%計，批號111645-200301）由中國藥品生物制品檢定所提供；八角蓮Dysosma versipellis（Hance．）M．Cheng（Podophyllum versipelle Hance．），由中南民族大學萬定榮教授鑒定和提供。

2、方法與結果

2.1 色譜條件

Diamonsiltm C18色譜柱（250mm×4．6mm，5μm）；流動相為甲醇-0．1mol/L磷酸二氫鉀（50∶50）；檢測波長290nm；流速1．0ml/ min；柱溫30℃；靈敏度：0．1AUFS；理論塔板數(shù)按鬼臼毒素峰計算不低于1500。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h的鬼臼毒素對照品適量，加甲醇制成每毫升約含0．5mg的溶液，搖勻，微孔濾膜過濾（0．45μm），得鬼臼毒素對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取八角蓮根莖和根粉末（過3號篩）各約0．5g，精密稱取，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，放置12h，稱定重量，超聲處理30min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，微孔濾膜過濾（0．45μm），得八角蓮根莖和根的供試品溶液。

2.4 八角蓮根莖和根HPLC譜圖比較

分別取八角蓮根莖和根供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀中，對其HPLC圖進行比較，比較可以看出，八角蓮根中基本不含鬼臼毒素成分。

2.5 線性關系考察

精密稱取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h的鬼臼毒素對照品25．5mg，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻（0．51×93．5%＝0．4769mg/ml），精密量取溶液1．0，2．0，3．0，4．0，5．0ml，分別置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，鬼臼毒素含量為橫坐標，繪制標準曲線，統(tǒng)計學計算回歸方程為：Y=0．01108X＋8．6782×10-3，r=0．9996。結果表明，鬼臼毒素的進樣量在0．04769～0．4769mg/ml的范圍內，濃度與峰面積呈良好。

2.6 精密度實驗

精密吸取鬼臼毒素對照品溶液10μl，按上述色譜條件，連續(xù)進樣5次，依次測定各峰的峰面積值，結果鬼臼毒素對照品RSD=0．24%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

精密吸取密封室溫保存的八角蓮根莖供試品溶液10μl，分別于0，2，5，8，10h進樣，測定其峰面積值，計算RSD=0．84%（n=3），結果表明，供試品溶液在10h內檢測對結果無影響，穩(wěn)定性良好。

2.8 重現(xiàn)性實驗

取同一批八角蓮根莖樣品，按供試品溶液制備方法平行制備5份供試液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，測定5份供試品中鬼臼毒素的含量，結果RSD=1．50%。

2.9 樣品測定

取3批八角蓮根莖樣品，按供試品溶液制備方法操作，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，用外標法測定，計算樣品中鬼臼毒素的含量。

2.10 加樣回收率實驗

取已知含量的八角蓮根莖樣品5份，各約0．25g，精密稱定，分別加入鬼臼毒素對照品2．55mg（2．55×93．5%＝2．3843mg），按供試品溶液制備方法操作，照上述色譜條件測定，計算回收率，結果平均回收率為99．94%，RSD=1．71%。

3、討論

3.1 八角蓮中鬼臼毒素的含量與提取方法有關

八角蓮的有效成分為鬼臼毒素，有文獻報道八角蓮經(jīng)80%甲醇超聲提取，測得鬼臼毒素的含量為0．94%，采用文中所用的甲醇超聲提取測得鬼臼毒素的含量為1．01%，結果表明，八角蓮中鬼臼毒素的含量可能與提取溶劑、方法等有一定關系，值得進一步研究。

3.2 八角蓮根中基本不含鬼臼毒素

通過比較八角蓮根與根莖的HPLC圖可以看出，八角蓮根中基本不含鬼臼毒素，實驗結果表明，主要是八角蓮的根莖具有鬼臼毒素的抗癌抗病毒活性。

本法測定八角蓮中鬼臼毒素的含量，樣品預處理簡單，有效成分分離良好，而且無其他成分干擾，對八角蓮藥材的質量控制有一定的參考價值。

[1]陳黎,涂自良,陳吉炎.高效液相色譜法測定八角蓮中鬼臼毒素的含量.論文網(wǎng),2011.08