塵螨變應(yīng)原rDer p1誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)胸腺基質(zhì)淋巴生成素的研究

倪春雅 高露娟 陳連軍 竇俠

塵螨變應(yīng)原rDer p1誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)胸腺基質(zhì)淋巴生成素的研究

倪春雅 高露娟 陳連軍 竇俠

目的探討塵螨變應(yīng)原rDer p1在體外對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)的影響。方法體外培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞，予以0.1、1和10 mg/L塵螨變應(yīng)原rDer p1與蛋白酶活化受體2(PAR2)特異性激動(dòng)劑SLGIKV(500 μmol/L)和拮抗劑VKGILS(500 μmol/L)共培養(yǎng)，以無(wú)血清培養(yǎng)基為空白對(duì)照。用ELISA法和熒光定量PCR法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組TSLP蛋白及mRNA表達(dá)水平；通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣流變化分析rDer p1誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生TSLP和PAR2受體活化的關(guān)系。結(jié)果1 mg/L和10 mg/L rDer p1組培養(yǎng)12 h上清中TSLP水平分別為(155.5±5.9)ng/L和(228.8±28.7)ng/L，顯著高于空白對(duì)照組(54.3±13.9 ng/L，P＜0.01)，TSLP表達(dá)水平隨rDer p1濃度增加而升高。SLGIKV組TSLP表達(dá)[(166.2±8.8)ng/L]也顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.01)。10 mg/L rDer p1組和SLGIKV組TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量在8 h最高，分別為(3.28±0.27)倍和(2.15±0.26)倍，與4 h和24 h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。SLGIKV可引起HaCaT細(xì)胞鈣內(nèi)流增加；10 mg/L rDer p1也可引起HaCaT細(xì)胞鈣內(nèi)流增加，經(jīng)過(guò)PAR2受體特異性阻斷劑VKGILS(500 μmol/L)處理后再給予rDer p1刺激，細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流峰值明顯降低。結(jié)論塵螨變應(yīng)原rDer p1能夠通過(guò)部分活化HaCaT細(xì)胞表面的PAR2受體誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TSLP。

皮炎，特應(yīng)性；屋塵螨；角蛋白細(xì)胞；胸腺基質(zhì)淋巴生成素

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種慢性炎癥性皮膚病。研究已證實(shí)大分子蛋白類(lèi)過(guò)敏原能夠誘發(fā)AD患者皮損復(fù)發(fā)或加重[1]，其中室內(nèi)過(guò)敏原塵螨是最常檢出的過(guò)敏原。AD患者進(jìn)行塵螨變應(yīng)原斑貼試驗(yàn)可誘發(fā)出濕疹樣皮損，進(jìn)一步免疫組化研究提示，塵螨變應(yīng)原能夠通過(guò)結(jié)合表皮內(nèi)特異性IgE介導(dǎo)Th2細(xì)胞活化，可能是其誘發(fā)AD皮炎加重的主要機(jī)制之一[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，上皮/表皮來(lái)源的促炎細(xì)胞因子胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP) 在促進(jìn)Th2細(xì)胞分化并啟動(dòng)過(guò)敏性炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用[3]。在AD患者皮損中可觀察到TSLP表達(dá)明顯上調(diào)，而AD患者非皮損處皮膚則幾乎不表達(dá)TSLP，提示TSLP和AD患者炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)[4]。本研究探討塵螨變應(yīng)原是否能夠通過(guò)直接活化角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生T SLP從而誘發(fā)皮炎。

材料與方法

一、材料

1.主要材料：人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞來(lái)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胎牛血清、Trizol、Fluo-4 NW鈣檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，屋塵螨變應(yīng)原rDerp1購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，蛋白酶激活受體2購(gòu)于PAR2特異性激動(dòng)劑SLIGKV和拮抗劑VKGILS購(gòu)于美國(guó)Tcoris公司，TSLP ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)RD公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本Takara公司，TSLP Taqman?探針(Hs00263639_m1)和GAPDH Taqman?探針(Hs99999905_m1)購(gòu)于美國(guó)ABI公司。

2.儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)于日本Airtech公司，ABI PRISM?7500熒光定量PCR購(gòu)于美國(guó)ABI公司，Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica公司，ELX800酶標(biāo)儀購(gòu)于德國(guó)Biokit公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及處理：HaCaT細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下用含10%胎牛血清和雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，以每孔105個(gè)細(xì)胞接種于無(wú)菌有蓋24孔板。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%融合時(shí)給予無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基同步化24 h，然后加入相應(yīng)抗原共培養(yǎng)，以無(wú)血清培養(yǎng)基為空白對(duì)照。rDer p1共培養(yǎng)終濃度分別為 0.1、1、10 mg/L；PAR2受體激動(dòng)劑SLIGKV終濃度為500 μmol/L。分別在培養(yǎng)12 h和24 h收集培養(yǎng)上清用于TSLP蛋白水平檢測(cè)；分別在培養(yǎng)4、8、24 h收集細(xì)胞用于提取RNA進(jìn)行TSLP mRNA表達(dá)水平定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清TSLP水平：按照人TSLP ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。簡(jiǎn)述如下：稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，按復(fù)孔加樣(濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照和待測(cè)上清)、生物素標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑，37℃孵育60 min，重復(fù)洗滌5次，拍干后加入顯色劑37℃避光顯色10 min，加入終止液，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(A值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)A值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)樣品的濃度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次。

3.熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定TSLP表達(dá)：Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，分光光度儀測(cè)定A260/A280比值判斷RNA純度并定量。依據(jù)Takara?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用MGBTaqman?探針?lè)ㄔ贏BI PRISM?7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，并比較不同時(shí)間和不同濃度塵螨變應(yīng)原刺激組TSLP(TSLP Taqman?探針：Hs00263639_m1；ABI) 表達(dá)水平， 以 GAPDH(GAPDH Taqman?探針：Hs99999905_m1；ABI)為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，PCR反應(yīng)體系如下：Taqman?Gene Expression Master Mix 12.5 μl， 目 的 基 因Taqman?探針引物 Mix 1.25 μl，cDNA 1.25 μl，H2O補(bǔ)足至 25 μl。反應(yīng)條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次。

4.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)活細(xì)胞鈣離子內(nèi)流：用Fluo-4 NW鈣檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鈣內(nèi)流。培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞于Lab-Tek?腔室玻片系統(tǒng)，生長(zhǎng)融合達(dá)50%時(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h。棄去培養(yǎng)基，用Fluo-4試劑盒中不含Ca2+的緩沖液洗2遍；每孔加入1 ml含F(xiàn)luo-4的染液，避光，依次37℃孵育30 min，室溫孵育30 min。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，選擇488 nm氬激光為激發(fā)波長(zhǎng)，設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)，記錄背景熒光；分別加入用緩沖液新鮮配制終濃度 10 mg/L的 rDer p1、 終濃度 500 μmol/L SLIGKV和空白緩沖液以及500 μmol/L VKGILS預(yù)處理30 min后再加入10 mg/L rDer p1，激光掃描共聚焦顯微鏡下動(dòng)態(tài)掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化，每3秒掃描記錄1次，連續(xù)測(cè)量90 s。LAS AF Lite-2.2.1分析軟件記錄和分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度圖像及曲線(xiàn)。

結(jié) 果

一、rDer p1誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)TSLP

各濃度塵螨變應(yīng)原rDer p1與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，上清液中TSLP表達(dá)高于空白對(duì)照組，并且隨rDer p1濃度增加TSLP水平顯著升高(表1)，以rDer p1 10 mg/L組最高(P＜0.01)；SLIGKV刺激組TSLP水平也高于空白對(duì)照組(P＜0.01)。延長(zhǎng)塵螨變應(yīng)原rDer p1共培養(yǎng)時(shí)間至24 h，TSLP表達(dá)與12 h的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，10 mg/L rDer p1和SLIGKV與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)，TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量都在8 h最高，顯著高于4 h和24 h(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表1 HaCaT細(xì)胞與屋塵螨變應(yīng)原rDer p1及蛋白酶激活受體2特異性激動(dòng)劑SLIGKV共培養(yǎng)上清中胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)表達(dá)水平(±s)

表1 HaCaT細(xì)胞與屋塵螨變應(yīng)原rDer p1及蛋白酶激活受體2特異性激動(dòng)劑SLIGKV共培養(yǎng)上清中胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)表達(dá)水平(±s)

注：a：各刺激組與空白對(duì)照比較t檢驗(yàn)，自由度為6

組別 12 h 24 h TSLP(ng/L) t值aP值 TSLP(ng/L) t值aP值空白對(duì)照組 54.3±13.9 - - 80.4±28.7 - -SLIGKV組 166.2±8.8 11.23＜0.01 135.2±33.8 2.47＜0.05 0.1 mg/L rDer p1組 59.4±15.4 0.44 ＞0.05 50.6±4.4 2.05 ＞0.05 1 mg/L rDer p1組 155.5±5.9 10.76＜0.01 142.2±26.0 3.19＜0.05 10 mg/L rDer p1組 228.8±28.7 10.31＜0.01 252.2±9.6 11.35＜0.01

表2 HaCaT細(xì)胞與屋塵螨變應(yīng)原rDer p1及蛋白酶激活受體2特異性激動(dòng)劑SLIGKV共培養(yǎng)不同時(shí)間胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)mRNA相對(duì)表達(dá)量(±s)

表2 HaCaT細(xì)胞與屋塵螨變應(yīng)原rDer p1及蛋白酶激活受體2特異性激動(dòng)劑SLIGKV共培養(yǎng)不同時(shí)間胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)mRNA相對(duì)表達(dá)量(±s)

注：各組不同刺激時(shí)間之間的比較采用單因素方差分析，自由度為2

組別 4 h 8 h 24 h F值 P值SLIGKV組 0.69±0.21 2.15±0.26 0.50±0.16 52.30＜0.01 1 mg/L rDer p1組 0.69±0.22 1.15±0.07 0.78±0.39 2.59 ＞0.05 10 mg/L rDer p1組 0.58±0.08 3.28±0.27 1.48±0.44 60.60＜0.01

二、rDer p1部分活化HaCaT細(xì)胞表面蛋白酶活化受體2產(chǎn)生鈣離子內(nèi)流

HaCaT細(xì)胞與10 mg/L rDer p1共培養(yǎng)，應(yīng)用鈣離子熒光指示劑在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可觀察到細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，出現(xiàn)鈣內(nèi)流增加，達(dá)峰時(shí)間約為20～25 s；SLIGVK也可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，達(dá)峰時(shí)間約為15～20 s，并且峰值平均吸光度高于Der p1組；HaCaT細(xì)胞經(jīng)過(guò)VKGILS處理后再加入塵螨變應(yīng)原rDer p1共培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流峰值明顯降低(圖1，2)。

討 論

TSLP是一種IL-7樣細(xì)胞因子，F(xiàn)riend等[5]首次從小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞中鑒定。近年來(lái)隨著人類(lèi)TSLP及其受體(TSLPR)的成功克隆和測(cè)序，對(duì)其功能有了較全面的了解。TSLP是一種上皮源性細(xì)胞因子，呼吸道上皮細(xì)胞和表皮角質(zhì)形成細(xì)胞均可合成TSLP。研究發(fā)現(xiàn)，TSLP與呼吸道過(guò)敏性炎癥的發(fā)生密切相關(guān)：哮喘患者支氣管黏膜上皮、過(guò)敏性鼻炎/鼻息肉患者鼻黏膜上皮TSLP表達(dá)均顯著升高[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者皮損中TSLP表達(dá)也明顯上調(diào)，而AD患者非皮損處皮膚則幾乎不表達(dá)TSLP[4]；表皮高表達(dá)TSLP的轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚呈現(xiàn)AD樣皮損表現(xiàn)，皮損中浸潤(rùn)細(xì)胞以炎癥性Th2細(xì)胞為主并伴有外周血IgE顯著升高[3]。由此可知，在以Th2細(xì)胞為主的過(guò)敏性炎癥(包括AD、哮喘及過(guò)敏性鼻炎)中TSLP均顯著升高。

圖1 HaCaT細(xì)胞經(jīng)PAR2受體特異性激動(dòng)劑SLIGKV、屋塵螨變應(yīng)原rDer p1(10 mg/L)刺激后鈣內(nèi)流一過(guò)性升高(以測(cè)定細(xì)胞內(nèi)平均熒光吸光度值所示)，經(jīng)PAR2受體特異性阻斷劑VKGILS預(yù)處理后rDer p1引起鈣內(nèi)流明顯下降

圖2 HaCaT細(xì)胞經(jīng)PAR2受體特異性激動(dòng)劑SLIGKV刺激后細(xì)胞內(nèi)熒光隨時(shí)間的變化，12 s時(shí)細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)明顯的綠色熒光，并持續(xù)至30 s

體外研究進(jìn)一步證實(shí)，TSLP能夠促進(jìn)CD11c+樹(shù)突細(xì)胞及皮膚內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞成熟、活化，并合成促使Th2細(xì)胞遷移的趨化因子TARC和MDC；同時(shí)經(jīng)TSLP活化的樹(shù)突細(xì)胞及朗格漢斯細(xì)胞能夠啟動(dòng)CD4+前體T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，并產(chǎn)生與過(guò)敏性炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子如白介素4、白介素5和白介素13等[4，8-9]。因此可以說(shuō)TSLP是一個(gè)啟動(dòng)Th2型過(guò)敏性炎癥反應(yīng)的重要“開(kāi)關(guān)”。

塵螨變應(yīng)原rDer p1除了具有免疫原性(誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgE型抗體)外，還具有半胱氨酸蛋白酶活性。研究證實(shí)，半胱氨酸蛋白酶可以與PAR2結(jié)合產(chǎn)生活化信號(hào)，并可進(jìn)一步動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)Ca2+介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[10]。PAR2受體在皮膚多種細(xì)胞，特別是角質(zhì)形成細(xì)胞表面表達(dá)，參與多種生理和病理過(guò)程，如，PAR2在調(diào)節(jié)表皮通透性屏障、參與皮炎和病理性瘙癢過(guò)程中均發(fā)揮作用[11]。體外研究發(fā)現(xiàn)，塵螨變應(yīng)原Der p1能夠通過(guò)PAR2受體活化誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子白介素6和白介素8[12]，塵螨來(lái)源的絲氨酸蛋白酶在體外也可通過(guò)PAR2受體活化誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生白介素8[13]。因此我們推測(cè)，具有半胱氨酸蛋白酶活性的rDer p1也可通過(guò)PAR2受體依賴(lài)的途徑活化角質(zhì)形成細(xì)胞。本研究以PAR2受體特異性激動(dòng)劑SLIGKV與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，HaCaT細(xì)胞表面PAR2受體活化能夠產(chǎn)生TSLP，并顯著高于空白對(duì)照組。進(jìn)一步通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察HaCaT細(xì)胞鈣內(nèi)流的變化來(lái)反映PAR2受體的活化，發(fā)現(xiàn)PAR2受體特異性激動(dòng)劑SLIGKV可引起HaCaT細(xì)胞顯著的鈣內(nèi)流，rDer p1也可引起HaCaT細(xì)胞中等程度的鈣內(nèi)流增加，如果HaCaT細(xì)胞給予PAR2受體特異性拮抗劑預(yù)處理以封閉受體，rDer p1引起的鈣內(nèi)流降低約50%。這一結(jié)果提示，塵螨變應(yīng)原rDer p1能夠部分通過(guò)結(jié)合并激活角質(zhì)形成細(xì)胞表面PAR2受體產(chǎn)生TSLP。本研究通過(guò)體外研究證實(shí)，塵螨變應(yīng)原rDer p1能夠部分與HaCaT細(xì)胞表面PAR2受體結(jié)合，產(chǎn)生活化信號(hào)，從而誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)Th2分化的促炎因子TSLP。

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2013-04-02)

(本文編輯：顏艷)

Effect of the house dust mite allergen rDer p1 on the production of thymic stromal lymphopoietin by human keratinocytes

Ni Chunya，Gao Lujuan，Chen Lianjun，Dou Xia.Department of Dermatology，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China

Dou Xia，Email:douxia@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate thein vitroeffect of the house dust mite allergen rDer p1 on the production of thymic stromal lymphopoietin(TSLP)by human keratinocytes.MethodsHuman HaCaT keratinocytes were cultured in the presence of different concentrations(0.1，1 and 10 mg/L)of rDer p1，SLGIKV(a specific agonist of protease-activated receptor-2，500 μmol/L)and VKGILS(a specific antagonist of protease-activated receptor-2，500 μmol/L)alone or in combination for different durations.Subsequently，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and fluorescence-based quantitative PCR were performed to detect the expression levels of TSLP protein in the culture supernatant of and TSLP mRNA in these cells respectively，confocal laser scanning microscopy was used to visualize intracellular calcium influx which reflected the activation of protease-activated receptor-2(PAR2).Those HaCaT cells cultured in serum-free medium served as the blank control group.Statistical analysis was done byttest and one-way analysis of variance.ResultsThe level of TSLP protein was(155.5±5.9)ng/L，(228.8±28.7)ng/L，and(166.2±8.8)ng/L in the culture supernatant of keratinocytes after 12-hour treatment with rDer p1 of 1 mg/L and 10 mg/L as well as SLGIKV respectively，significantly higher than that in the blank control group((54.3±13.9)ng/L，allP＜0.01).The TSLP mRNA expression in keratinocytes peaked at 8 hours after the stimulation with rDer p1 of 10 mg/L and SLGIKV separately，with the relative expression levels being(3.28±0.27)folds and(2.15±0.26)folds，respectively，which were significantly different from those at 4 and 24 hours(allP＜0.01).Both SLGIKV and rDer p1 of 10 mg/L promoted intracellular calcium influx in keratinocytes，while the pretreatment with VKGILS obviously inhibited the rDer p1-induced increase in intracellular calcium influx.ConclusionsThe house dust mite allergen rDer p1 may induce the production of the pro-inflammatory cytokine TSLP by human keratinocytes partly via activating PAR2 receptors.

Dermatitis，atopic；Dermatophagoides pteronyssinus；Keratinocytes；Thymic stromal lymphopoietin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.003

國(guó)家自然科學(xué)基金(30901289)

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科

竇俠，Email：douxia@medmail.com.cn