microRNA-101增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡

張積廣

福建省立醫(yī)院胸外科，福建福州 350001

非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率及病死率高，對(duì)放化療不敏感，療效欠佳。紫杉醇是非小細(xì)胞肺癌治療的一線化療藥物，臨床應(yīng)用較廣泛，其抗腫瘤機(jī)制主要是通過(guò)凋亡促使腫瘤細(xì)胞死亡，而凋亡抵抗是惡性腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)特征，嚴(yán)重降低紫杉醇的治療效果，因此有效提高紫杉醇促凋亡功能，可增強(qiáng)其抗腫瘤作用，提高其療效。microRNA 是單鏈非編碼小分子RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，是腫瘤學(xué)近年研究的熱點(diǎn)，據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道m(xù)iRNA 可改變腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。該研究起止時(shí)間為2013年1月—2014年5月，旨在闡明miR-101 促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，并探討其可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

H358(支氣管肺泡癌)和H226(鱗癌)細(xì)胞株購(gòu)自ATCC，細(xì)胞株在含10% FBS、含雙抗(100 IU 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素)的RPMI-1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2 miRNA-101mimics 和siRNA 的細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照Lipofectamine 2000 說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將適當(dāng)數(shù)量肺癌細(xì)胞接種于96 孔或6 孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6 h，更換培養(yǎng)液為含10%FBS 的DMEM。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR

用Trizol 從細(xì)胞中提取總RNA。

①microRNA-101 表達(dá)檢測(cè)

按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下。

2×Real-time PCR Buffer 10 μL，miR specific Primer set(5μmol/L)0.6 μL miRNA RT product(物稀釋3 倍)2 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.2 μL，dd H2O To 20 μL?；靹蛏鲜龈鹘M分，95 ℃3 min,95 ℃12 s，58 ℃40 s，40 個(gè)循環(huán)，PCR 反應(yīng)在ABI 7500 熒光定量PCR 儀上完成。U6 作為內(nèi)參，用2-△△ct 法計(jì)算。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

②EZH2-mRNA 表達(dá)檢測(cè)

按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下。

上、下游引物各(10 μmol/L)1 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(稀釋10 倍)1 μL，Add H2O to final 25 μL。將上述各部分混勻。95 ℃60 s；95 ℃15 s，56 ℃15 s，72 ℃45 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.4 Western Blot

每個(gè)孔均加入細(xì)胞裂解液充分搖勻，在冰上作用30 min 后進(jìn)一步離心后吸取上清液，蛋白濃度用Bi-Rad 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定，-70℃保存于深低溫冰箱。取30 μg 樣品進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，在室溫下封閉1 h 后分別與相應(yīng)一抗、二抗充分相互作用，最后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行檢測(cè)。將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將肺癌細(xì)胞接種于6 孔板中，轉(zhuǎn)染方法同前，將每種細(xì)胞分為4 組即siRNA-EZH2 組、siRNA 陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染miR-101組、miRNA 陰性對(duì)照組。將紫杉醇（終濃度為40 nmol/L）加入轉(zhuǎn)染72 h 后細(xì)胞，并孵育48 h。將收集的每組細(xì)胞分為倆份，一份用于Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)，而另外一份用于western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均以SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 miR-101 過(guò)表達(dá)或EZH2 基因沉默增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡

非小細(xì)胞肺癌H358 和H226 細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的藥物敏感性低，因而被用于該研究。EZH2 是miR-101 的靶基因，具有癌基因特性，促進(jìn)非非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，因此將沉默EZH2 表的siRNA-EZH2 作為陽(yáng)性對(duì)照。miR-101 mimics 或siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h 后再加入紫杉醇培養(yǎng)48 h，用流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明miR-101 過(guò)表達(dá)或EZH2 基因沉默(圖A)顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著上升(圖B 和圖C)。

圖A miR-101 mimics 或siRNA-EZH2 的轉(zhuǎn)染效果通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)miR-101 或EZH2 mRNA 的表達(dá)而確認(rèn)。miR-101：轉(zhuǎn)染miR-101 組；miR-CON：轉(zhuǎn)染miRNA 陰性對(duì)照組；siRNA-EZH2：轉(zhuǎn)染siRNA-EZH2 組；siCON：轉(zhuǎn)染siRNA 陰性對(duì)照組。

圖B annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡。數(shù)據(jù)以相應(yīng)陰性對(duì)照組作為標(biāo)準(zhǔn)化顯示。Apoptotic cells：凋亡細(xì)胞。

圖C 具有代表性流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖顯示miR-101 過(guò)表達(dá)或沉默EZH2 增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.2 miR-101 抑制EZH2 表達(dá)并增強(qiáng)凋亡相關(guān)蛋白Bim 和cleaved PARP 的表達(dá)

為了研究miR-101 增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的可能機(jī)制，同時(shí)我們亦收集上述與紫杉醇培養(yǎng)48 h 后的肺癌細(xì)胞，用于檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白。既往研究提示促凋亡蛋白Bim 是決定腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性的重要因子[2]，而EZH2 抑制Bim 表達(dá)[3]，所以我們檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白EZH2、Bim、和cleaved PARP 的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EZH2 蛋白在miR-101 和siRNA-EZH2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)的陰性對(duì)照組，而B(niǎo)im 和cleaved PARP 蛋白在miR-101 和siRNA-EZH2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的陰性對(duì)照組(圖D 和圖E)。

圖D Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白EZH2,Bim 和cleaved PARP的表達(dá)。β-actin 作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以相應(yīng)陰性對(duì)照組作為標(biāo)準(zhǔn)化顯示。

圖E 具體代表性的wenstern blot 條帶顯示miR-101 or siRNAEZH2 增加Bim 和cleaved PARP 蛋白的表達(dá).以上所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。*P<0.05;** P<0.001。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌對(duì)化學(xué)藥物治療不敏感，且預(yù)后通常欠佳[4-6]，這種狀況在過(guò)去的幾十年中并未得到改善。紫杉醇是當(dāng)前廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌治療的臨床一線藥物，主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，雖然其取得一定臨床治療成績(jī)，但并不理想，若能進(jìn)一步提高其療效則有益于肺癌患者。因此，檢測(cè)miR-101 能否增進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡及其可能的機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。該研究顯示提高miR-101 表達(dá)或沉默EZH2 基因均能促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)亦降低EZH2 蛋白表達(dá)和增強(qiáng)Bim 蛋白表達(dá)。先前文獻(xiàn)研究顯示Bim能增進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性，而下調(diào)Bim基因表達(dá)則顯著減少紫杉醇導(dǎo)致的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞死亡，此表明Bim 是連接紫杉醇和凋亡之間的一個(gè)重要分子。EZH2 已經(jīng)被證實(shí)能通過(guò)后生性抑制Bim 表達(dá)而減少腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)合上述科研成果，研究結(jié)果提示miR-101 調(diào)節(jié)紫杉醇誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌凋亡的機(jī)制如下：由miR-101 介導(dǎo)的EZH2 低表達(dá)誘導(dǎo)Bim 蛋白生成，因此增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌凋亡。

綜上，在非小細(xì)胞肺癌中miR-101 能增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果提示miR-101 和EZH2 可能成為臨床非小細(xì)胞肺癌治療的潛在新靶點(diǎn)，有望改善非小細(xì)胞肺癌患者的臨床治療效果。

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