人乳頭瘤病毒型別及載量與尋常疣臨床特征相關(guān)性研究

張紅葉 郭宗科 董正邦 嚴(yán)翹 王飛

人乳頭瘤病毒型別及載量與尋常疣臨床特征相關(guān)性研究

張紅葉 郭宗科 董正邦 嚴(yán)翹 王飛

目的探討人乳頭瘤病毒型別、載量與尋常疣臨床特征的相關(guān)性。方法提取48例尋常疣組織DNA；正反向測序通用引物PCR擴(kuò)增片段，通過blast比對分型，并通過型別特異性引物PCR來驗(yàn)證和補(bǔ)充測序結(jié)果；實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對定量ΔCt法檢測HPV病毒載量；HE染色法觀察病理變化。結(jié)果35例HPV PCR檢測陽性的標(biāo)本中HPV 7型32例；HPV 57型1例，為四肢末端多發(fā)；HPV 2和HPV 7混合感染2例，為頭面部、軀干多發(fā)病例。單發(fā)組與多發(fā)組、病程＜6個(gè)月組與病程6個(gè)月至1年組病毒載量、空泡化細(xì)胞數(shù)目無明顯差異，1年后病毒載量有下降趨勢，病程＞2年的皮損，角化過度更明顯，空泡化細(xì)胞減少。結(jié)論尋常疣的HPV感染型別主要是HPV 7；HPV 7型感染好發(fā)于頭面部；對于病程1年內(nèi)的尋常疣，HPV病毒載量及空泡化細(xì)胞數(shù)目與其數(shù)目、病程長短無明顯相關(guān)性。

人乳頭瘤病毒；疣；病毒載量；疾病特征

尋常疣是常見的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染皮膚黏膜引起的良性贅生物，其發(fā)病率高，可發(fā)生于身體任何部位，常好發(fā)于易受外傷部位，單發(fā)或多發(fā)，65%患者可在2年內(nèi)自行消退[1]，部分則發(fā)展為巨大疣。尋常疣發(fā)病部位、單發(fā)與多發(fā)、病程長短與轉(zhuǎn)歸，病理變化，是否與感染的HPV特異性型別、病毒載量有關(guān)，目前研究不多。本研究通過通用引物PCR擴(kuò)增后測序及型別特異性PCR檢測尋常疣中HPV型別，實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對定量ΔCt法測定病毒載量水平，分析HPV型別及載量與尋常疣臨床表現(xiàn)及病理變化的相關(guān)性。

資料與方法

一、資料

1.病例資料:48例尋常疣皮損標(biāo)本均來自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院皮膚性病科門診就診的典型的尋常疣患者，收集臨床資料，包括性別、年齡、病程、皮損部位、皮損特征、單發(fā)或多發(fā)及隨訪情況。其中男30例，女18例，平均(43.5±19.7)歲(12～89歲)；單發(fā)組30例，多發(fā)組18例；頭面部32例，四肢末端9例，軀干部9例；病程 ＜1年35例，病程 ≥1年13例，其中病程≥2年5例。6例正常包皮組織來自于東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科就診的包皮過長的患者，包皮提供者均簽署知情同意書。同一患者同一部位的多發(fā)皮損，取一份標(biāo)本；同一患者不同部位的多發(fā)皮損則分部位分別取材，一份用于型別載量的測定，一份用于病理檢查。尋常疣組織標(biāo)本及包皮組織于-80℃保存。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2.主要儀器和試劑:Eppendorf PCR基因擴(kuò)增儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品，Gel Doc凝膠掃描成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，DY-A電泳儀為上海生化所西巴斯生物科技開發(fā)公司產(chǎn)品，HC-2518R高速冷凍離心機(jī)為合肥科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品，電動(dòng)組織研磨器為江蘇大地自動(dòng)化儀器廠產(chǎn)品，蛋白酶K為美國Sigma公司產(chǎn)品，Takara熱啟動(dòng)酶反應(yīng)盒為大連Takara公司產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker為美國Axygen公司產(chǎn)品。

3.引物:內(nèi)參引物PC03/05、通用引物MY09/11均參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[2]，分別擴(kuò)增人β珠蛋白209 bp、HPV L1 450 bp片段，PC03/05引物序列:上游引物5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3'、下游引物5'-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3'；MY09/11 引物序列:上游引物5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3'、下游引物5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'(混合堿基 M=A+C、R=A+G、W=A+T、Y=C+T)。根據(jù)文獻(xiàn)中尋常疣感染的常見型別，對標(biāo)本DNA 進(jìn)行 HPV 2、4、7、27、57這 5個(gè) HPV 型別的型別特異性引物PCR(TSP-PCR)，以上各型型別特異性引物均有兩套，一套參照以往文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[2-3]，命名為TSP舊；一套由杭州赫貝科技有限公司設(shè)計(jì)，命名為TSP新，各套型別特異性引物序列、擴(kuò)增片段及產(chǎn)物大小見表1。

表1 型別特異性引物序列、擴(kuò)增片段及產(chǎn)物大小

二、方法

1.組織標(biāo)本DNA的提取:稱取約100 mg的組織，加入消化緩沖液，研磨至組織消失后加入蛋白酶k溫育消化；分別加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)及等體積氯仿/異戊醇(24∶1)，17 000 ×g、4℃離心15 min提純，取上清；加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉溶液和2體積的無水乙醇，-20℃中靜置1 h后再同前離心30 min，棄上清；加70%乙醇振蕩洗滌，加入TE緩沖液，使終濃度為1 mg/ml，-20℃保存。提取的DNA液以PC03/05擴(kuò)增人β珠蛋白，驗(yàn)證提取模板質(zhì)量。

2.HPV型別檢測:DNA提取液以MY09/11為通用引物擴(kuò)增HPV L1片段，反應(yīng)體系為:緩沖液5 μl，dNTP 4 μl， 上下游引物各 0.8 μl，Takara 熱啟動(dòng)酶0.3 μl，DNA 模板 6 μl，加 dH2O 至總體積 50 μl；擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ 2 min，變性94℃ 30 s，退火53℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，再延伸72℃ 5 min，循環(huán)數(shù)35。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)450 bp陽性條帶的，擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司處理，進(jìn)行正反雙向測序，對測序序列進(jìn)行拼接后在NCBI的blast上比對，判定HPV型別。同時(shí)，每份DNA提取液均以表1所示的5個(gè)特異性型別HPV的兩套引物系統(tǒng)作引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，判定是否為表1中的5個(gè)特異性型別。反應(yīng)體系為: 緩沖液 2.5 μl，dNTP 2 μl， 上下游引物各0.4 μl，Takara 熱啟動(dòng)酶 0.15 μl，DNA 模板 3 μl，加dH2O至總體積25 μl；擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃2 min，變性94℃ 30 s，退火62℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，再延伸72℃ 5 min，循環(huán)數(shù)25。

3.HPV載量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測:將HPV 7型的DNA提取液以表1中TSP 7新為引物擴(kuò)增，進(jìn)行HPV 7型病毒載量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，由杭州赫貝科技有限公司完成，擴(kuò)增條件:預(yù)變性95℃ 5 min，變性95℃ 25 s，退火 62℃ 30 s，延伸 72℃ 35 s，循環(huán)數(shù)40。結(jié)果依據(jù)2-ΔCt計(jì)算。

4.組織病理檢查:疣體較大的尋常疣標(biāo)本，將其一分為二，一半予4%甲醛固定后，進(jìn)行HE染色，鏡下觀察，并對每個(gè)標(biāo)本選取3個(gè)不同高倍鏡(×400)視野進(jìn)行空泡化細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)，取平均值代表組織空泡化細(xì)胞數(shù)目水平。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SSPS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對獲得的病毒載量、組織病理空泡化細(xì)胞數(shù)目等數(shù)據(jù)以±s表示，對符合正態(tài)分布的各組數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)選擇0.05。

結(jié) 果

一、HPV型別測定結(jié)果

48例尋常疣標(biāo)本中，43例證實(shí)DNA提取成功；有5例提取失敗，且其中2例為病程超過2年患者。6例正常包皮組織均提取DNA成功。

圖1 通用引物MY09/11 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物；1～14:尋常疣組織標(biāo)本；N:包皮組織標(biāo)本

1.通用引物PCR測序分型結(jié)果:在DNA提取成功的43例中，35例均在450 bp處出現(xiàn)陽性條帶(圖1)；其中2例提取DNA成功的病程超過2年的病例，HPV通用引物PCR定性均陰性；6例正常包皮組織均未出現(xiàn)450 bp條帶。35例中1例為HPV 57型，為四肢末端、多發(fā)、病程12個(gè)月的病例；其余34例均為HPV 7型。

表2 型別特異性PCR分型結(jié)果(例)

圖2 尋常疣TSP-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖 2a:HPV 7感染；2b:HPV 2/7混合感染；2c:HPV 57感染。M:標(biāo)準(zhǔn)參照物；1～5:分別為同一尋常疣組織標(biāo)本的TSP新 2、4、7、27、57擴(kuò)增產(chǎn)物；1*～5*:分別為同一尋常疣組織標(biāo)本的TSP舊 2、4、7、27、57擴(kuò)增產(chǎn)物

2.型別特異性PCR分型結(jié)果:兩套引物的分型結(jié)果一致顯示，1例同通用引物PCR測序結(jié)果為HPV 57型，2例為HPV 2和HPV 7混合感染型，為頭面部、多發(fā)、病程＜1年病例，其中1例還合并有軀干部皮損；其余32例均為HPV 7型。具體分型結(jié)果見表2，圖2。

二、HPV載量測定結(jié)果

選取HPV 7型感染的單發(fā)組、多發(fā)組各8個(gè)樣本DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測HPV病毒載量，其中14例病程在1年以內(nèi)，1例為12個(gè)月，1例為18個(gè)月，這兩例病毒載量均較其他病例明顯減少，2-ΔCt結(jié)果分別為1978.165、773.259。組間載量情況比較，單發(fā)組與多發(fā)組、病程＜6個(gè)月組與病程6個(gè)月至1年組病毒載量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

三、組織病理結(jié)果

選取單發(fā)組、多發(fā)組各9例的皮損行組織病理檢查，16例為HPV 7型感染、病程≤ 1年的病例，2例為提取DNA失敗、病程 ＞2年的病例。HE染色，病理顯示18例組織標(biāo)本均表現(xiàn)典型的尋常疣組織病理改變，空泡化細(xì)胞計(jì)數(shù):單發(fā)組與多發(fā)組、病程＜6個(gè)月組與病程6個(gè)月至1年組的空泡化細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05(表4)；2例病程＞2年的空泡化細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為19、22，比病程＜2年的角化過度更明顯，空泡化細(xì)胞減少。

討 論

表3 組間HPV載量情況比較(±s)

表3 組間HPV載量情況比較(±s)

組別 例數(shù) 載量2-ΔCt P值單發(fā)組 8 2189.77±853.06 ＞0.05多發(fā)組 8 2893.84±1093.18病程＜6個(gè)月組 9 2724.06±1067.07 ＞0.05 6個(gè)月至1年組 6 2531.00±656.11

表4 尋常疣組織病理空泡化細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)結(jié)果(±s)

表4 尋常疣組織病理空泡化細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)結(jié)果(±s)

組別 例數(shù) 空泡化細(xì)胞數(shù)目 P值單發(fā)組 9 42±15 ＞0.05多發(fā)組 9 41±10病程＜6個(gè)月組 8 44±13 ＞0.05 6個(gè)月至1年組 8 45±8

既往有關(guān)于尋常疣HPV型別的研究表明:在歐洲人群中尋常疣的感染型別主要是HPV2、27、57[4]，日本則為HPV1、4、65[5]，德國的主要流行型別是HPV1、2、4、10、27、57、65[6]。 在中國，Lei等[7]發(fā)現(xiàn)北京48例尋常疣標(biāo)本HPV主要型別為 1、2、27、57。Chen等[8]發(fā)現(xiàn)中國臺灣61例尋常疣標(biāo)本主要型別為 HPV 1、2、4、5。 通過檢測尋常疣的常見型別發(fā)現(xiàn):HPV 4型可以導(dǎo)致病程的延長[9]；HPV 2與皮損形態(tài)有相關(guān)性[7]。感染HPV 2型的尋常疣更傾向于多發(fā)，皮損體積偏大，且對治療療效不好[10-11]；HPV 57有惡變傾向[12]，且多發(fā)生于掌跖部[13]。本實(shí)驗(yàn)在測定HPV型別的方法選取上，考慮到對于有混合感染的標(biāo)本，HPV擴(kuò)增效率不一樣時(shí)或一種型別的HPV的量比另一種高很多，通用引物PCR可能使其中一型的產(chǎn)物占絕對優(yōu)勢，這時(shí)測序法就無法分辨出另一種型別，造成假陰性，故用通用引物PCR測序分型，再通過型別特異性引物PCR驗(yàn)證和補(bǔ)充通用引物PCR的測序結(jié)果。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)在型別特異性PCR的引物選取中，每個(gè)型別都通過兩套引物系統(tǒng)擴(kuò)增HPV不同的基因組區(qū)域進(jìn)行驗(yàn)證，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)中，型別特異性PCR檢測2例為HPV 2、HPV 7混合感染的病例，而通用引物PCR測序分型卻為HPV 7單一型別。

通過結(jié)合兩種方法的型別測定，本實(shí)驗(yàn)中35例尋常疣HPV感染型別32例是HPV 7型，2例是HPV 2、HPV 7混合感染，1例是HPV 57型。32例HPV 7型尋常疣既有發(fā)生于四肢末端(11.1%)，也有發(fā)生于頭面部(72.2%)，及軀干部(16.6%)，說明其主要發(fā)生于頭面部，亦可發(fā)生于其他任何部位；這32例HPV 7感染患者也無職業(yè)特殊性，與皮損形態(tài)、單發(fā)或多發(fā)無特定關(guān)系。2例HPV 2型的感染，均為多發(fā)，且皮損形態(tài)都是菜花樣成簇分布，這2例同時(shí)感染有HPV 7型，HPV 2、7均屬于α-HPV，說明HPV 2型有合并同種屬其他HPV型別的混合感染的傾向。其中1例HPV 2/7的感染，為發(fā)生于面部、軀干及肛周的多發(fā)皮損，說明HPV 2、7可以發(fā)生于肛周生殖器部位。本實(shí)驗(yàn)中只發(fā)現(xiàn)1例HPV 57感染，也是發(fā)生于手部的多發(fā)皮損，由于例數(shù)太少，無法確定其與尋常疣形態(tài)、數(shù)目的關(guān)聯(lián)性。

由于PCR基因分型結(jié)果大部分尋常疣是HPV 7感染，故本實(shí)驗(yàn)中僅測定了HPV7型尋常疣的病毒載量，發(fā)現(xiàn)HPV 7型病毒載量與疾病的單發(fā)、多發(fā)無明顯相關(guān)，與1年以內(nèi)的病程長短亦無明顯相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中觀察到空泡化細(xì)胞數(shù)目多少與疾病的單發(fā)、多發(fā)及1年以內(nèi)的病程長短無明顯相關(guān)，而2例病程＞2年的皮損出現(xiàn)相對于病程＜2年的角化過度更明顯，空泡化細(xì)胞減少的現(xiàn)象。而空泡化細(xì)胞是HPV病毒活力的象征[14]，空泡化細(xì)胞減少預(yù)示病毒對宿主細(xì)胞的致病性減弱，從而可以解釋尋常疣可自行消退的臨床表現(xiàn)。但此推論還需更多病程時(shí)間長的尋常疣組織標(biāo)本的病理檢查來進(jìn)一步驗(yàn)證。

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2014-01-01)

(本文編輯:吳曉初)

Association analysis between human papillomavirus genotypes and viral load and clinical featuresof verruca vulgaris

Zhang Hongye*，Guo Zongke，Dong Zhengbang，Yan Qiao，Wang Fei.*Department of Dermatology，Nanjing Children's Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing 210008，China

Wang Fei，Email：ffwangfei@163.com

ObjectiveTo study the association between human papillomavirus(HPV)genotypes and viral load and clinical features of verruca vulgaris.MethodsTissue samples were collected from 48 outpatients with verruca vulgaris，and DNA was extracted from these tissue samples.To determine the genotype of HPV，PCR was performed to amplify the L1 fragment of HPV with universal primers followed by bidirectional sequencing and BLAST.The genotyping results were validated by PCR with type-specific primers.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was conducted to measure the viral load of HPV，and hematoxylin and eosin(HE)staining to observe histological changes in these tissue specimens.ResultsThe L1 fragment of HPV was amplified from 35 out of the 48 tissue specimens.Of the 35 L1-positive specimens，32 harbored HPV 7，1 harbored HPV 57，and 2 harbored both HPV 2 and HPV 7.Multiple lesions were observed on extremities in the patient infected with HPV 57，but on the head，face and trunk in the patients coinfected with HPV 2 and HPV 7.There were no significant differences in HPV viral load or vacuolated cell number between patients with single lesions and those with multiple lesions，or between patients with a clinical course of＜ 6 months and those with a clinical course of 6-12 months.However，HPV viral load tended to decrease one year after the onset，and there was pronounced hyperkeratosis and less vacuolated cells in lesions of long duration(more than 2 years)compared with those of short duration(less than 2 years).Conclusions HPV 7 appears to be the most common HPV genotype associated with verruca vulgaris，and HPV 7 infection usually occurs on the head and face.For verruca vulgaris of less than 1 year，neither HPV viral load nor vacuolated cell number is associated with the count or clinical course of warts.

Human papillomavirus；Warts；Viral load；Disease attributes

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.006

江蘇省自然科學(xué)基金面上研究項(xiàng)目(BK2012748)；南京市科技發(fā)展項(xiàng)目(201104028)

210008南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院皮膚科(張紅葉)；東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院燒傷整形外科(郭宗科)，皮膚科(董正邦、嚴(yán)翹、王飛)

王飛，Email:ffwangfei@163.com