松散型花椰菜小孢子植株再生研究

單曉政+文正華+劉莉莉+姚星偉+江漢民+吳峰+牛國保+孫德嶺

摘 要：以松散型花椰菜子葉型小孢子胚為外植體，研究冷處理、活性炭及AgNO3對小孢子植株再生的影響。結(jié)果表明：對小孢子胚進行3 d的4 ℃冷處理培養(yǎng)，能提高其胚芽誘導率和胚芽數(shù)；培養(yǎng)基中添加1.0 g·L-1的活性炭對提高小孢子胚芽誘導率沒有明顯效果，但能有效減輕胚芽的玻璃化；添加5.0～7.0 mg·L-1的AgNO3對小孢子胚芽誘導有顯著效果。

關(guān)鍵詞：松散型花椰菜；小孢子胚；植株再生

中圖分類號：S635.3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.06.001

相對于緊實型花椰菜，松散型花椰菜花球松散、梗青球白、生脆可口、味道鮮美，近年來逐漸贏得我國消費者的喜愛，種植面積不斷擴大。利用游離小孢子技術(shù)獲得松散型花椰菜小孢子植株或DH群體已有報道[1]，雖然松散型花椰菜小孢子培養(yǎng)的產(chǎn)胚率相對較高，但小孢子胚在分化和繼代培養(yǎng)中，仍然存在褐化、玻璃化、愈傷化、停止生長和畸形生長等現(xiàn)象，直接影響小孢子植株的再生率。已有報道稱基因型、胚齡、瓊脂濃度、培養(yǎng)基添加物等都是影響小孢子植株再生的重要因素[2-3]，而適當?shù)睦涮幚?、干燥處理、子葉切除等能提高小孢子胚的植株再生能力。

本文探討了冷處理、活性炭和AgNO3對松散型花椰菜小孢子植株再生的影響，旨在進一步完善游離小孢子培養(yǎng)體系，并為該技術(shù)在蔬菜育種中的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

‘津松65、‘津松70等8個松散型花椰菜品種由天津科潤蔬菜研究所花椰菜課題組提供。

1.2 方 法

將供試材料進行游離小孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)方法參考顧宏輝[1]的方法，將獲得的子葉型小孢子胚狀體置于光照下，轉(zhuǎn)綠后，即可用于小孢子胚芽誘導試驗。將變綠后的子葉型胚轉(zhuǎn)入基本培養(yǎng)基（MS+6-BA0.2 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂13.5 g·L-1）中進行培養(yǎng)，其中以高出胚率品種‘津松65和‘津松70的小孢子胚為試材，研究冷處理、活性炭和AgNO3對小孢子胚芽誘導的影響。3種處理設(shè)置條件為：將剛轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基的胚置于光照培養(yǎng)箱中4 ℃冷處理3 d，以冷處理0 d為對照；在基本培養(yǎng)基中添加1.0 g·L-1活性炭，以不添加活性炭為對照；在基本培養(yǎng)基中分別添加1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mg·L-1的AgNO3，以不添加AgNO3為對照。每個處理接種小孢子胚24個，3次重復，25 d后統(tǒng)計胚芽誘導率和胚芽數(shù)。胚芽誘導率=出芽胚狀體數(shù)/接種胚狀體數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷處理對小孢子胚芽再生的影響

對2個供試材料的小孢子胚進行3 d的冷處理后，胚芽誘導率和出芽數(shù)均有顯著提高（表1）。經(jīng)冷處理后，‘津松65的胚芽誘導率由52.0%提高到了83.0%，平均出芽數(shù)也由2.37 個·胚-1增加到2.89個·胚-1，‘津松70的胚芽誘導率由61.8.0%提高到88.3%，而平均出芽數(shù)由0.68個·胚-1提高到了1.83個·胚-1。

2.2 活性炭對小孢子胚芽再生的影響

活性炭處理后，2個供試材料的小孢子胚芽誘導率和出胚數(shù)與對照相比差異不顯著（表2）。

但在添加活性炭的培養(yǎng)基中生長的胚芽出現(xiàn)玻璃化的概率減小，并且長成的幼苗比較健壯，成活率較高，而未添加活性炭的培養(yǎng)基中的胚芽玻璃化現(xiàn)象較嚴重。

2.3 AgNO3在小孢子胚芽再生中的作用

從表3可以看出，在培養(yǎng)基中分別添加5.0～7.0 mg·L-1的AgNO3，小孢子胚芽分化率和胚平均出芽數(shù)與不添加AgNO3相比均差異顯著。‘津松65在添加7.0 mg·L-1的AgNO3時，胚芽誘導率提高到83.7%，添加了5.0 mg·L-1的AgNO3后，平均出芽數(shù)達到2.85個·胚-1，‘津松70在添加5.0 mg·L-1的AgNO3后，胚芽誘導率提高到98.2%，而平均出芽數(shù)由0.76個·胚-1提高到了2.26個·胚-1。這表明在培養(yǎng)基中附加5.0～7.0 mg·L-1的AgNO3可顯著提高松散型花椰菜小孢子胚芽誘導率和每個胚狀體分化芽的數(shù)量。

2.4 再生苗的繼代、生根和移栽

將獲得的胚芽切下接種到繼代培養(yǎng)基中，之后每20～30 d繼代1次，可以使芽苗長得健壯。經(jīng)繼代3～4次的芽苗接種到含NAA的生根培養(yǎng)基中，15 d左右即可長出健壯的根系，通常經(jīng)繼代的芽苗較不經(jīng)繼代的芽苗生根速度快、根短粗、成活率高。將組培苗移栽到自然環(huán)境生長前要煉苗1～2 d，之后移栽于含蛭石∶草炭（1∶2）的營養(yǎng)缽中，并進行遮蔭保濕。

3 結(jié)論與討論

冷處理、活性炭和AgNO3在小孢子培養(yǎng)中的作用已有大量報道，但在小孢子植株再生中的作用研究較少。Ritala[4]對大麥小孢子胚進行4個星期的4 ℃處理，可以明顯提高生成苗的效率；周偉軍等[5]對油菜小孢子再生研究時發(fā)現(xiàn)，在胚狀體移入固體再生培養(yǎng)基后立即進行10 d的低溫誘導處理（2 ℃），常溫光下培養(yǎng)，可以直接、快速再生成苗，成苗率達62.5%，且再生植株的生長狀況與無低溫誘導的再生植株無明顯區(qū)別；Zhang[6]對油菜小孢子胚狀體進行3 d或5 d的冷處理，能使胚發(fā)芽率和成苗率分別提高到90.0%和58.48%。本試驗將小孢子胚在4 ℃處理3 d，發(fā)現(xiàn)胚芽誘導率最高可達到90%以上，說明冷處理對提高胚芽的再生確實有效。

韓陽[7]在大白菜小孢子植株再生研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加200 mg·L-1活性炭可以大幅度提高小孢子胚成苗率，其原理可能是活性炭吸附了瓊脂中不利于細胞生長的某些物質(zhì)。其他研究者也曾報道活性炭對小孢子胚狀體發(fā)生有很好的促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)添加活性炭與未添加活性炭小孢子胚芽誘導無明顯差異，這可能跟活性炭濃度有關(guān)，活性炭濃度較高反而對胚芽誘導沒有明顯促進作用。但是，本試驗中發(fā)現(xiàn)，在添加活性炭的培養(yǎng)基中生長的胚芽在之后的培養(yǎng)中玻璃化現(xiàn)象明顯減輕，這說明活性炭可能在克服小孢子胚芽玻璃化方面有重要作用。

AgNO3作為一種乙烯抑制劑經(jīng)常被用于植物離體培養(yǎng)中。許多研究指出，在植物離體培養(yǎng)中，AgNO3不僅能提高芽誘導率，還能有效抑制褐化。唐桂香[8]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加AgNO3能顯著提高甘藍型油菜子葉的不定芽分化誘導率。趙秀樞[9]發(fā)現(xiàn)，AgNO3在羽衣甘藍不定芽誘導過程中起抑制作用。高紅亮[10]在不結(jié)球白菜離體再生研究中發(fā)現(xiàn)添加5～10 mg·L-1AgNO3可顯著提高不定芽分化率和每個外植體分化芽的數(shù)量。楊曉楓[11]發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜外植體愈傷組織誘導率和芽再生率與AgNO3密切相關(guān)。本試驗將AgNO3用于松散型花椰菜小孢子植株再生中，也發(fā)現(xiàn)適宜濃度的AgNO3在一定程度上提高了松散型花椰菜小孢子胚芽誘導率和再生率，但濃度過高對胚芽再生起抑制作用。

參考文獻：

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AgNO3作為一種乙烯抑制劑經(jīng)常被用于植物離體培養(yǎng)中。許多研究指出，在植物離體培養(yǎng)中，AgNO3不僅能提高芽誘導率，還能有效抑制褐化。唐桂香[8]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加AgNO3能顯著提高甘藍型油菜子葉的不定芽分化誘導率。趙秀樞[9]發(fā)現(xiàn)，AgNO3在羽衣甘藍不定芽誘導過程中起抑制作用。高紅亮[10]在不結(jié)球白菜離體再生研究中發(fā)現(xiàn)添加5～10 mg·L-1AgNO3可顯著提高不定芽分化率和每個外植體分化芽的數(shù)量。楊曉楓[11]發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜外植體愈傷組織誘導率和芽再生率與AgNO3密切相關(guān)。本試驗將AgNO3用于松散型花椰菜小孢子植株再生中，也發(fā)現(xiàn)適宜濃度的AgNO3在一定程度上提高了松散型花椰菜小孢子胚芽誘導率和再生率，但濃度過高對胚芽再生起抑制作用。

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