不同年齡白內障晶狀體上皮細胞中caspase—3、Fas/FasL的表達及意義

李延輝+++++葉仕英+++++何小杰+++++徐飛+++++袁煜宗

[摘要] 目的 探討不同年齡白內障晶狀體上皮細胞（LECs）中caspase-3、Fas/FasL的表達及臨床意義。 方法 選擇2007年9月～2012年2月本院眼科收治的白內障患者50例為研究對象，其中25～49歲設為白內障中青年組，≥50歲設為白內障老年組，各25例，并收集20例成人尸體解剖非白內障眼球為對照組，其中25～49歲設為中青年對照組，≥50歲設為老年對照組，各10例。采用免疫組織化學法檢測各組晶狀體前囊膜組織中caspase-3、Fas、FasL的表達。 結果 白內障老年組、白內障中青年組、老年對照組和中青年對照組LECs中凋亡細胞百分率分別為34.0%、16.0%、2.0%、3.0%，白內障老年組顯著高于白內障中青年和老年對照組，白內障中青年組顯著高于中青年對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。白內障老年組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達率分別為84.0%、60.0%、68.0%，白內障中青年組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達率分別為44.0%、24.0%、32.0%，老年對照組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達率分別為10.0%、10.0%、20.0%，中青年對照組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達率分別為10.0%、0.0%、0.0%，4組caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。老年白內障患者和中青年白內障患者中，LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達水平均呈正相關（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01）。 結論 老年性白內障形成過程可能與LECs的凋亡及caspase-3、Fas/FasL的表達調控有關。

[關鍵詞] 白內障；caspase-3；Fas；FasL；晶狀體上皮細胞

[中圖分類號] R776.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）11（a）-0015-03

白內障是目前世界上第一位致盲眼病，其發(fā)病機制十分復雜，目前臨床上尚無切實有效的預防藥物。因此，通過各種先進研究技術的綜合應用深入白內障發(fā)病機制，抓住凋亡相關基因在白內障發(fā)生、發(fā)展中的作用機制從而研發(fā)相關分子作用靶點，已成為一項十分有益于防治白內障的課題[1-2]。caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，近年來相關資料顯示，caspase-3可能參與了白內障晶狀體上皮細胞（lens epithelial cells，LECs）的凋亡和白內障的形成[3-4]。目前對Fas/FasL系統(tǒng)的凋亡機制研究多數(shù)集中于其在腫瘤發(fā)病機制中的作用及意義[5-6]，而對該系統(tǒng)在白內障發(fā)生過程中的作用機制尚不明確[7]。本研究通過免疫組織化學法對不同年齡白內障患者及正常人的晶狀體上皮中caspase-3、Fas/FasL的表達水平進行檢測，旨在初步探討caspase-3、Fas/FasL在不同年齡白內障發(fā)生過程中所具有的分子生物學功能，為預防白內障發(fā)生及開發(fā)更有效的藥物治療提供新的實驗依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2007年9月～2012年2月本院眼科收治的白內障患者50例為研究對象，其中25～49歲設為白內障中青年組，≥50歲設為白內障老年組，各25例。其中白內障中青年組，男14例（14眼），女11例（11眼），年齡25～47歲，平均（35.6±1.6）歲；白內障老年組，男13例（13眼），女12例（12眼），年齡50～79歲，平均（62.4±2.6）歲。兩組患者均在常規(guī)白內障顯微手術過程中采用連續(xù)環(huán)形撕囊，晶狀體前囊膜的直徑約為5 mm。另選擇暨南大學附屬第一醫(yī)院病理科進行成人尸體解剖的眼球晶狀體前囊膜標本20例，均證實無白內障發(fā)生，其中25～49歲設為中青年對照組，≥50歲設為老年對照組，各10例。4組晶狀體前囊膜標本均經10%中性緩沖甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL方法檢測細胞凋亡 采用TUNEL法檢測4組晶狀體前囊膜標本中的細胞凋亡情況。TUNEL法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，操作方法及過程嚴格按照試劑盒要求步驟進行。檢測結果判定：光鏡下觀察，LECs細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒者為凋亡細胞，而染為藍色的細胞核為正常LECs細胞。每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算凋亡細胞百分率：細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.2 免疫組織化學檢測 采用免疫組織化學EnVision法檢測各組LECs中caspase-3、Fas/FasL的表達。操作方法及過程嚴格按照EnVision法試劑盒要求步驟進行。染色結果判斷[6]：LECs胞質或胞膜內見黃色或棕色顆粒為染色陽性。每張切片隨機選擇檢查5個視野，計數(shù)100個細胞，計數(shù)陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞率。0～5%為（-）；6%～19%為（+）；20%～35%為（++）；36%～50%為（+++）。（+）～（+++）記為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)整理分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，各指標之間的關系分析采用等級相關檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組LECs凋亡情況的比較

白內障老年組、白內障中青年組、老年對照組和中青年對照組LECs中凋亡細胞百分率分別為34.0%、16.0%、2.0%、3.0%，4組凋亡細胞百分率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.82，P<0.01）。白內障老年組顯著高于白內障中青年組和老年對照組（χ2=9.27、11.59，P<0.01），白內障中青年組顯著高于中青年對照組（χ2=7.59，P<0.01）。

2.2 4組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達的比較

白內障老年組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達率分別為84.0%（21/25）、60.0%（15/25）、68.0%（17/25），白內障中青年組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達率分別為44.0%（11/25）、24.0%（6/25）、32.0%（8/25），老年對照組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達率為10.0%（1/10）、10.0%（1/10）、20.0%（2/10），中青年對照組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達率為10.0%（1/10）、0.0%、0.0%，4組caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.19、8.43、9.11，P<0.01）。

2.3 LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達之間的關系

25例老年白內障患者和25例中青年白內障患者中，LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達水平均呈正相關（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01）。

3 討論

近年來研究表明，LECs的損害是白內障發(fā)生過程中的早期事件，除先天性白內障以外，其他類型的白內障形成均與LECs發(fā)生凋亡密切相關。推測LECs發(fā)生凋亡后，致使LECs的密度降低，LECs下面的晶狀體纖維滲透壓失去平衡，最終部分晶狀體纖維的透明性和完整性受到不良影響[8-9]。本研究結果顯示，白內障老年組、白內障中青年組、老年對照組和中青年對照組LECs中凋亡細胞百分率分別為34.0%、16.0%、2.0%、3.0%，白內障老年組顯著高于白內障中青年和老年對照組，白內障中青年組顯著高于中青年對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示在白內障的發(fā)生過程中，LECs發(fā)生凋亡可能是其細胞學基礎，尤其在老年性白內障的發(fā)生過程中可能起重要的作用。

caspase-3是近年來發(fā)現(xiàn)的致使哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶[10-11]，在亞硒酸鹽誘導的大鼠晶狀體上皮細胞凋亡過程中，caspase-3酶活性增高并起關鍵作用，提示caspase-3可能參與了晶狀體上皮細胞凋亡和白內障的形成。國內一些研究結果發(fā)現(xiàn)，caspase-3在白內障的發(fā)病機制中占有重要地位。研究認為促凋亡基因Fas與FasL的相互作用及其構成的復雜體系，是多種細胞凋亡的發(fā)生機制之一。Fas屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，而FasL屬于TNF家族的Ⅱ型膜蛋白，兩者結合在凋亡過程中具有誘導細胞發(fā)生凋亡的作用[12]。目前對Fas/FasL系統(tǒng)的凋亡機制研究多數(shù)集中于其在腫瘤發(fā)病機制中的作用及意義，而對該系統(tǒng)在白內障發(fā)生過程中的作用機制尚不明確。

本研究采用免疫組織化學法檢測不同年齡白內障患者及正常人的晶狀體上皮中凋亡相關基因caspase-3、Fas/FasL的表達情況，結果表明4組caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），老年性白內障患者LECs中caspase-3、Fas、FasL的陽性表達率均明顯高于白內障中青年患者和正常對照組，白內障中青年患者LECs中caspase-3、Fas、FasL的陽性表達率均明顯高于正常對照組；同時對LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達之間的關系進行分析，發(fā)現(xiàn)老年性白內障患者和中青年白內障患者中，LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達水平均呈正相關（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01），提示caspase-3、Fas/FasL可能參與了白內障形成過程，且在老年性白內障形成過程中具有更重要的作用。推測LECs受到外界各種不同刺激后，caspase-3蛋白酶系統(tǒng)首先被激活，晶狀體內外鈣離子流動失去正常時的平穩(wěn)狀況，細胞骨架及晶體連接蛋白逐漸被降解；同時也激活了FasL-Fas系統(tǒng)，大量FasL-Fas表達并結合，從而提供誘導凋亡的傳導信號，晶狀體連接蛋白進一步被降解，水電平衡失調以及LECs發(fā)生大量凋亡的病理改變，推動白內障的形成進程[13-15]。

綜上所述，老年性白內障形成過程可能與LECs的凋亡及caspase-3、Fas/FasL的表達調控有關，相信隨著對白內障形成機制的不斷深入了解及凋亡機制的逐漸明確，調節(jié)caspase-3、Fas/FasL表達的相關分子靶點藥物的進一步開發(fā)及應用，都將為預防白內障及其非手術治療方案的研發(fā)提供新的指導方向。

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（收稿日期：2014-09-30 本文編輯：郭靜娟）