無創(chuàng)肢體缺血預(yù)處理快速相與延遲相疊加對大鼠皮瓣缺血再灌注損傷的影響

陳江湖++++++鄭曉春++++++李榮鋼++++++涂文劭

[摘要] 目的 探討無創(chuàng)肢體缺血預(yù)處理快速相與延遲相疊加對大鼠皮瓣缺血再灌注（IR）損傷的影響。 方法 選擇200～300 g健康雄性SD大鼠48只，將其隨機分成單純IR組、快速相（EPC）組、延遲相（DPC）組、EPC與DPC疊加（EDPC）組，每組各12只。通過實驗設(shè)計建立動物模型，觀察對比各組皮瓣IR后血清LDH、MDA、GSH-Px、SOD變化情況以及皮瓣存活率。 結(jié)果 EDPC組的MDA、LDH含量明顯低于其他3組（P<0.05），而GSH-Px、SOD及皮瓣成活率明顯高于其他3組（P<0.05）。 結(jié)論 無創(chuàng)肢體缺血預(yù)處理快速相與延遲相疊加對大鼠IR皮瓣具有保護作用且優(yōu)于單一的快速相或延遲相的作用。

[關(guān)鍵詞] 肢體缺血預(yù)處理；快速相；延遲相；缺血再灌注；皮瓣；大鼠

[中圖分類號] R743.31 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）11（a）-0009-04

無創(chuàng)肢體缺血預(yù)處理（noninvasive limb ischemic preconditioning，NLIP）是指通過上肢或下肢、單側(cè)或雙側(cè)的短時間缺血預(yù)處理從而減輕遠隔組織器官的缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）損傷。目前研究認為，NLIP對大鼠的許多臟器具有確切的早期和延遲保護作用[1-3]，即快速相（early preconditioning，EPC）和延遲相（delayed preconditioning，DPC）。EPC主要是由于缺血、缺氧等直接剌激機體釋放腺苷等保護性介質(zhì)[4-5]，其保護作用在預(yù)處理后數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)，持續(xù)2～3 h，而DPC主要是NLIP激活復(fù)雜的信號傳遞鏈，最終導(dǎo)致心臟保護基因翻譯的增加[6-7]，其保護作用在預(yù)處理12～24 h出現(xiàn)，作用強度弱，但時間持續(xù)3～4 d。EPC和DPC的效應(yīng)特點及機制不盡相同，特別是產(chǎn)生時間不同，本研究通過在大鼠NLIP24 h后再施加1次NLIP，實現(xiàn)大鼠NLIP的EPC效應(yīng)和DPC效應(yīng)重疊，探討兩時相疊加對大鼠IR皮瓣的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

200～300 g健康雄性SD大鼠48只，體重在270～330 g，由福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，在福建省立醫(yī)院動物實驗室分籠喂養(yǎng)，每籠4只，每天給予標(biāo)準飼料，清潔自來水自由飲用。動物房環(huán)境溫度22～24℃，相對濕度70%左右，實驗前飼養(yǎng)1周以熟悉環(huán)境。

1.2 實驗分組

將所有動物按體重進行編號，根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分成4組，每組12只。單純IR組：分離皮瓣并實施缺血6 h/再灌注8 h（IR）處理，但未進行NLIP；快速相（EPC）組：實施阻斷/開放右后肢血流各5 min連續(xù)3次循環(huán)（NLIP），30 min后立即對皮瓣實施IR處理；延遲相（DPC）組：實施NLIP24 h后對皮瓣實施IR處理；快速相與延遲相疊加（EDPC）組：實施NLIP24 h后再實施1次NLIP，30 min后對皮瓣實施IR處理。

1.3 肢體缺血預(yù)處理（LIP）模型的建立

參考張連元等[8]的方法，多功能監(jiān)護儀監(jiān)測大鼠右后肢脈搏波，將纏繞了橡皮筋的塑料管套入大鼠右后肢并盡量推向后肢根部，然后將橡皮筋從管上退下。由于橡皮筋的彈性回縮，會緊緊地結(jié)扎在大鼠右后肢根部，壓迫了股動脈而阻斷右后肢血流，當(dāng)大鼠右后肢缺血5 min后，剪斷橡皮筋恢復(fù)右后肢血流灌注5 min。以監(jiān)護儀顯示的右后肢脈搏波消失為阻斷血流成功，以脈搏波恢復(fù)為血流恢復(fù)。如此反復(fù)實施肢體IR 3個循環(huán)為1次NLIP。

1.4 皮瓣IR模型的建立

按Petry等[9]描述的方法，術(shù)前禁食6 h，自由飲水。采用腹腔內(nèi)注射10% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉，取仰臥位固定于實驗臺上，腹部去毛，于左下腹設(shè)計1個以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小為6 cm×3 cm。充分游離腹壁淺血管至其在股動靜脈發(fā)出點，游離發(fā)出點近端的股動靜脈，原位縫合皮瓣備用。因腹壁淺血管極細小，極易被手術(shù)器械損傷，根據(jù)Petry等[9]的描述，本研究用無損傷血管夾阻斷腹壁淺血管的近端血管股動靜脈血流，造成腹壁淺血管支配皮瓣的缺血，在缺血期間每2小時按0.15 ml/100 g腹腔內(nèi)追加注射10%水合氯醛以維持大鼠麻醉狀態(tài)。6 h后松開止血夾恢復(fù)血流灌注8 h完成1次IR。以監(jiān)護儀顯示的左后肢脈搏波消失為阻斷血流成功，以脈搏波恢復(fù)為血流恢復(fù)。

1.5設(shè)備與試劑

PM9000型多功能監(jiān)護儀（邁瑞醫(yī)療國際公司），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、乳酸脫氫酶（LDH）測試盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測試盒，以上測試盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.6 血清酶學(xué)檢測

每實驗組隨機抽取6只大鼠在IR后即刻經(jīng)頸內(nèi)動脈抽取3～5 ml血液，放37℃恒溫箱靜置1 h后，3000 r/min，離心5 min，分離血清進行檢測。嚴格按照產(chǎn)品說明書操作，檢測血清LDH、MAD、SOD、GSH-Px。

1.7 皮瓣成活率檢測

其余6只大鼠在IR后第7 天，用數(shù)碼相機進行皮瓣照相后，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算皮瓣成活率：皮瓣成活率（%）=皮瓣成活面積/皮瓣總面積×100%。皮瓣壞死標(biāo)準：皮瓣色澤變黑、表面黑色結(jié)痂，質(zhì)地堅硬，彈性消失，切割組織不出血。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組血清GSH-Px和SOD活力、MDA和LDH含量的比較

與IR組比較，EPC、DPC、EDPC組的GSH-Px和SOD活力均升高，血清LDH、MDA含量均降低（P<0.05或P<0.01）；其中，EDPC組的GSH-Px和SOD活力最高（P<0.05），其次為EPC組；EDPC組的血清LDH、MDA含量最低（P<0.05），EPC組略低于DPC組（P>0.05）（表1）。

表1 4組血清GSH-Px和SOD活力、MDA和LDH含量的

比較（x±s，n=6）

與IR、DPC組比較，*P<0.05，與IR、EPC、DPC組比較，#P<0.05

2.2 4組皮瓣成活率的比較

EDPC組的皮瓣成活率[（84.30±7.53）%]明顯高于其他3組（P<0.05或P<0.01），而IR組的皮瓣成活率[（31.69±15.19）%]最低（P<0.01），EPC組[（69.41±11.53%）]雖略高于DPC組[（67.23±10.50）%]，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。

3 討論

1986年Murry等[10]在心臟實驗中發(fā)現(xiàn)短暫的心肌缺血能夠?qū)﹄S后長時間缺血的心肌起保護作用，并把這一現(xiàn)象命名為缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IPC），此后IPC在動物實驗和臨床上不斷得到證實，但這種直接在臟器上進行的IPC不僅操作困難，同時也是對臟器的一種損傷，1996年Gho等[11]發(fā)現(xiàn)將小腸或者腎臟缺血15 min，對冠狀動脈阻閉60 min的心肌也有保護作用，可顯著縮小心肌梗死面積，這一發(fā)現(xiàn)將IPC的保護作用從同一器官延伸到不同器官，表明IPC是機體對缺血性損傷的整體性反應(yīng)，而不是局限性反應(yīng)?，F(xiàn)將這種非直接對IR損傷的器官或組織進行IPC的方式稱為遠程缺血預(yù)適應(yīng)（remote ischemic preconditioning，RPC）。Oxman等[12]在1997年研究發(fā)現(xiàn)下肢IPC后對IR的心肌亦具有保護作用，這一現(xiàn)象同樣屬于RPC的一部分，但因?qū)χw進行的IPC，具有更簡便，無創(chuàng)的特點，故又被稱之為NLIP，其可通過對非重要臟器的短暫缺血而減輕重要生命器官的IR損傷，且操作簡單易行，具有較大的臨床應(yīng)用價值。2002年Küntscher等[13]通過觀察IR后大鼠腹部皮瓣，發(fā)現(xiàn)LIP亦能明顯改善皮瓣的成活率，此后，皮瓣IR模型因制備簡單，逐漸成為研究LIP特點及機制最簡便、最常用的動物模型。

既往研究表明，IPC的保護作用存在兩個時相：EPC和DPC。EPC在預(yù)處理后數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)，保護作用較強，只持續(xù)2～3 h，而DPC在預(yù)處理12～24 h出現(xiàn)，作用強度弱，但時間持續(xù)3～4 d，因而具有更重要的臨床意義。2005年Loukogeorgakis等[14]報道RPC對人體內(nèi)皮IR損傷可產(chǎn)生早期和晚期階段的保護作用，說明RPC的保護作用也具有快速相和延遲相兩個時相，兩時相出現(xiàn)時間相距12～24 h。本研究通過兩次相距24 h的NLIP實現(xiàn)LIP快速保護作用和延遲保護作用的重疊，實驗發(fā)現(xiàn)EPC與DPC疊加處理后皮瓣的成活率明顯比單獨的EPC、DPC高，表明NLIP的EPC與DPC實現(xiàn)了疊加，并產(chǎn)生了強于單獨EPC或DPC的保護作用。

IR和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，LIP機制中減輕遠隔臟器氧源損傷是一個重要方面，本研究也在氧化/抗氧化機制方面進行探討。IR損傷導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）等氧自由基大量產(chǎn)生，抗氧化酶如GSH-Px和SOD等的活性降低，組織中脂質(zhì)過氧化嚴重，MDA含量增加。LDH存在于所有組織細胞中，是參與糖無氧酵解的重要酶，在IR損傷過程中，LDH作為損傷指標(biāo)能反映組織細胞的受損程度。本研究中EPC、DPC組的大鼠血清GSH-Px、SOD的活力明顯高于IR組，而LDH和MDA的含量明顯降低，表明EPC、DPC均能有效提高機體清除氧自由基的能力，保護組織細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，此結(jié)果與既往的大量研究相似，而本研究中的EDPC組大鼠血清的GSH-Px、SOD的活力明顯高于EPC、DPC、IR組，而LDH和MDA的含量亦明顯低于其他3組，進一步證實兩次間隔24 h的NLIP能實現(xiàn)快速保護作用和延遲保護作用的疊加，能更有效提高機體清除氧自由基的能力，產(chǎn)生更強的保護作用。EPC主要是由于缺血、缺氧等直接剌激機體釋放腺苷、一氧化氮、緩激肽、去甲腎上腺素等介質(zhì)及誘發(fā)神經(jīng)反射[4-5，15]，通過擴張血管、清除自由基、抑制炎癥反應(yīng)等機制起到保護心肌的作用，而DPC主要是IPC誘導(dǎo)了一氧化氮合成酶、環(huán)氧合酶-2、抗氧化酶和熱休克蛋白等保護性蛋白質(zhì)的合成，通過激活復(fù)雜的信號鏈而觸發(fā)預(yù)適應(yīng)，最終導(dǎo)致心臟保護基因翻譯的增加[6-7，16]。本研究認為EPC與DPC的作用機制不同，且EPC起效僅需數(shù)分鐘，在DPC起效，即保護性蛋白質(zhì)合成后，第2次的NIPC可刺激機體再次迅速釋放保護性介質(zhì)及誘發(fā)神經(jīng)反射，通過擴張血管、清除自由基及抑制炎癥反應(yīng)等機制進一步加強保護作用，從而實現(xiàn)快速保護作用和延遲保護作用的疊加，產(chǎn)生更強的保護作用。

綜上所述，NLIP的EPC與DPC能實現(xiàn)疊加，且兩時相疊加后對皮瓣的保護作用明顯優(yōu)于單純EPC或DPC，但其作用機制仍未明確，有待進一步研究證實。

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（收稿日期：2014-08-14 本文編輯：許俊琴）

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（收稿日期：2014-08-14 本文編輯：許俊琴）

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（收稿日期：2014-08-14 本文編輯：許俊琴）