山東省孤獨癥4號染色體基因掃描研究*

楊樹林 楊 帆 翟 靜 劉金同 張 燕 陳 剛

孤獨癥(autism)是兒童廣泛性發(fā)育障礙(pervasive developmental disorder，PDD)的一種類型，以三主征為主要表現(xiàn)，即言語發(fā)育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板。發(fā)病后患者的社會能力將受到嚴(yán)重影響，有較高的致殘率，給社會和患者家庭帶來沉重負擔(dān)。近年的流行病學(xué)研究顯示，孤獨癥的患病率比以往有明顯增加，美國為4/10 000～10/10 000、歐洲為10/10 000、中國2.8/10 000 ～11/10 000，男女比例為(4 ～10)∶1［1，2］。本研究以山東省 38 個孤獨癥核心家系及正常對照者為研究對象，使用覆蓋4號染色體的22個微衛(wèi)星遺傳位點進行了基因組掃描，并通過關(guān)聯(lián)分析尋找孤獨癥的相關(guān)性位點。

1 對象和方法

1.1 對象 以國際疾病分類10版(ICD-10)為診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇就診于山東省精神衛(wèi)生中心的孤獨癥核心家系，包括:患者38例，其中女性患者2例，男性患者36例，年齡為2～10歲，平均年齡(5.10±1.61)歲;患者父母75名，其中女性38名，男性37名;1 000名正常對照選自山東省血液中心的健康獻血者，女性570名，男性430名，年齡為 18～53歲，平均年齡(22.2±4.45)歲。本研究得到了山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會的批準(zhǔn)，對受試者均進行了知情告知。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備 采用酚-氯仿法提取外周血樣本中的基因組DNA。采用nanodrop 1000微量光度計測量DNA濃度，每個樣本測量兩次，取平均值。用無菌去離子水將樣品稀釋至20 ng/μl。

1.2.2 DNA混合池(DNA pooling)的構(gòu)建 每組每個樣品取10 μl DNA溶液混合，分別構(gòu)建患者組、對照組和患者父母組的DNA混合池。混合池DNA終濃度為20 ng/μl。

1.2.3 遺傳位點的選擇 選擇針對4號染色體的Linkage Mapping Set2.5 套裝試劑盒(Applied Biosystem，美國)，共22個微衛(wèi)星位點。引物的標(biāo)記熒光分別為綠色、藍色和黃色，分子量標(biāo)記熒光為橙色。

1.2.4 PCR反應(yīng) 使用Gene Amp 9700 DNA擴增儀(Applied Biosystem，美國)進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系總體積為 15 μl，包括:DNA 模板 1.5 μl(20 ng/μl)，PrimeSTAR HS Premix(Takara)7.5 μl，等量正反向引物混合液 1 μl(5 μM)，無菌去離子水 5 μl。反應(yīng)程序為降落式PCR(Touch Down PCR):94℃變性90 s，63℃退火90 s(每循環(huán)一次，退火溫度降低0.5℃)，72 ℃延伸90 s，14個循環(huán);94 ℃變性30 s，56℃退火90 s，72℃ 延伸90 s，30個循環(huán);72℃延伸7 min;4℃保存。

1.2.5 毛細管凝膠電泳及基因分型 按照PCR產(chǎn)物熒光顏色和片段大小的不同，將PCR產(chǎn)物搭配組合進行電泳觀察。患者組、對照組和患者父母組分別上樣，取混合后的 PCR 產(chǎn)物 4 μl與 9 μl上樣液(0.15 μl Liz 500，9 μl去離子甲酰胺)混合 ，加入96孔板中。95℃變性5 min，并迅速冰浴冷卻。使用ABI-3130(Applied Biosystem，美國)毛細管電泳儀進行電泳觀察。試驗數(shù)據(jù)由GeneMapper4.0軟件(Applied Biosystem，美國)進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 樣品經(jīng)過PCR擴增和基因分型后，即可得到等位基因圖譜(allele image pattern，AIP)。圖譜中峰的數(shù)量為遺傳位點上的等位基因數(shù)量，峰高則代表對應(yīng)等位基因的染色體數(shù)量。每個混合池中染色體的數(shù)量并不相等，相同位點兩組間的信號強度不可直接比較。所以，首先算出各等位基因占所有等位基因的比率，再乘以總?cè)旧w數(shù)，即可得到該等位基因在相應(yīng)實驗組中的染色體數(shù)量。以對照組為例，人類為二倍體核型，1 000例對照組樣本在常染色體上的遺傳位點由2 000個等位基因組成，將某個等位基因的比率乘以2 000即可得到相應(yīng)等位基因在混合池中的染色體數(shù)量?；颊呓M與患者父母組使用相同方法計算。采用CLUMP軟件對患者組和對照組、患者組和患者父母組每個位點上的等位基因頻率進行比較。兩組間基因頻率差異以P＜0.01作為有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

最終得到3個混合池樣本4號染色體上22個微衛(wèi)星位點的等位基因圖譜。根據(jù)圖譜計算各組位點中等位基因的染色體數(shù)量，采用CLUMP軟件統(tǒng)計比較各組間等位基因頻率的差異(見表1)。發(fā)現(xiàn)患者組與患者父母組的等位基因頻率在D4S392(4q13.3)位點有顯著性差異(P＜0.01);患者組與對照組的等位基因頻率在D4S1535(4q35.1)位點有顯著性差異(P＜0.01)。進行3次重復(fù)實驗，結(jié)果得到一致性驗證，確認(rèn)此位點與孤獨癥呈現(xiàn)關(guān)聯(lián)。與孤獨癥相關(guān)聯(lián)的D4S392(4q13.3)位點和 D4S1535(4q35.1)位點的等位基因圖譜見圖1和圖2。

表1 孤獨癥患者組、患者父母組與對照組的4號染色體微衛(wèi)星位點掃描關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

圖1 孤獨癥患者組、患者父母組與對照組的D4S392位點基因掃描圖

圖2 孤獨癥患者組、患者父母組與對照組的D4S1535位點基因掃描圖

3 討論

孤獨癥屬于多基因遺傳病，有較高的遺傳異質(zhì)性，遺傳因素在孤獨癥的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，其遺傳度約為91%［2，3］。關(guān)聯(lián)與連鎖分析被較多地用于孤獨癥易感基因的研究。孤獨癥的分子遺傳學(xué)研究中也常以孤獨癥譜系疾病(autism spectrum disorder，ASD)和廣義孤獨癥(broad autism phenotype)作為研究對象。近20年來，國際上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些孤獨癥遺傳位點。其中已確定與孤獨癥連鎖的遺傳位點和基因有24個，分別是 7q22(AUTS1)、13q14(AUTS3)、15q11(AUTS4)、2q(AUTS5)、17q11(AUTS6)、17q21(AUTS7)、3q25-q27(AUTS8)、7q31(AUTS9)、7q36(AUTS10)、1q41(AUTS11)、21p13-q11(AUTS12)、12q14(AUTS13)、16p11.2(AUTS14A 、AUTS14B)、CNTNAP2基因(AUTS15)、SLC9A9基因(AUTS16)、SHANK2基因 (AUTS17)、CHD8 基因 (AUTS18)、NLGN3基因(AUTSX1)、NLGN4 基因(AUTSX2)、MECP2 基因(AUTSX3)、Xp22.11(AUTSX4)、RPL10基因(AUTSX5)和TMLHE基因(AUTSX6)。

迄今，對4號染色體與孤獨癥之間的相關(guān)性也進行了一系列的關(guān)聯(lián)與連鎖分析。Schellenberg等［4］以微衛(wèi)星為遺傳學(xué)標(biāo)記對孤獨癥患者進行了全基因組掃描研究，通過連鎖不平衡分析，在有女性患者的家系中發(fā)現(xiàn)4號染色體上存在易感位點。Field等［5］在對有閱讀障礙患者家系的關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)4q13.1、7q36.1-q36.2、7q36.3、16p12.1 和17q22 五個位點的 lod 值大于2.3，與疾病存在關(guān)聯(lián)。其中4q13.1位點與兒童多動癥存在關(guān)聯(lián)，7q36.1-q36.2、7q36.3、16p12.1 和17q22位點與孤獨癥存在關(guān)聯(lián)。Zuo等［6］發(fā)現(xiàn)4號染色體上的ADH基因是非洲裔美國人精神分裂癥和歐洲裔美國人孤獨癥的危險因素。但是，Auranen等［7］對芬蘭隔離人群中的孤獨癥復(fù)雜家系進行了配對連鎖分析和同胞對分析中并未發(fā)現(xiàn)4號染色體上存在孤獨癥的易感性位點。

核型分析是遺傳性疾病病因研究的重要方法。人們發(fā)現(xiàn)染色體的異位、倒位、缺失和重迭在孤獨癥的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用，同時也是尋找孤獨癥易感基因的重要途徑。Sabaratnam M等［8］報道了一例有dup(4)p12-p13染色體畸變的18歲女性孤獨癥患者。Ramanathan S等［9］報道了一例有 46，XY del 4(q31.3-q33)染色體畸變的孤獨癥患者，他們又通過分子遺傳學(xué)的研究方法發(fā)現(xiàn)該患者存在AMPA2基因，GLRA3基因，GLRB基因，NPY1R基因和NPY5R基因的半合子狀態(tài)，這些基因在學(xué)習(xí)、記憶能力和某些神經(jīng)遞質(zhì)的表達中起到重要作用。Vincent JB等［10］報道了兩個有46，XY，inv(4)(p12-p15.3)染色體畸變的孤獨癥同胞，這個畸變可能影響到了γ-氨基丁酸受體基因家族，并由此引發(fā)孤獨癥。為了驗證γ-氨基丁酸系統(tǒng)對孤獨癥的影響，Collins AL等［11］以高加索人種和非洲裔美國人種的孤獨癥復(fù)雜家系進行了研究，通過對35個SNP位點的篩查，他們發(fā)現(xiàn)這兩個人種在GABRB1基因和GABRA4基因中均存在陽性位點。Chien WH 等［12］報道了兩個在 4q35.1-35.2 區(qū)域和8p23.2-pter分別存在 6.8 Mb 和 2.4 Mb 缺失的男性孤獨癥患者，而且這種染色體畸變在其他患者和正常對照人群中均未被發(fā)現(xiàn)。Shimada S等［13］報道了一例有智力障礙和孤獨癥癥狀的塞-科二氏綜合征的患者，通過染色體表型分析，發(fā)現(xiàn)該患者在4q13.2和7p21.1區(qū)域同時存在缺失。與同樣存在7p21.1區(qū)域缺失的此類患者相比，該患者的精神癥狀較重，所以4q13.2區(qū)域的缺失可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因。

此外，其他研究方法也表明4號染色體上存在孤獨癥的易感位點。三堿基重復(fù)序列在人類DNA中廣泛存在，如CCG等，研究表明這些重復(fù)序列的變化可以影響某些疾病的遺傳易感性，如雙向情感障礙、精神分裂癥、孤獨癥和焦慮癥。Kleiderlein JJ等［14］通過cDNA探針發(fā)現(xiàn)4q35區(qū)域就存在這種重復(fù)序列。在DNA拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)的研究中，Gau SS等［15］報道了一例孤獨癥患者在 4q12-13.1和5q32區(qū)域存在分別為4.5 Mb和1.8 Mb的CNVs，這兩處變異分別來自無任何孤獨癥癥狀的患者母親和父親，所以可能是這兩處變異的綜合效應(yīng)導(dǎo)致了孤獨癥的發(fā)生。

在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)患者組與對照組的等位基因頻率在D7S513(7p21.3)位點有顯著性差異(P＜0.01)［16］。此次對4 號染色體的研究中，我們發(fā)現(xiàn)患者組與患者父母組的等位基因頻率在D4S392位點(4q13.3)有顯著性差異(P ＜0.01);患者組與對照組的等位基因頻率在D4S1535位點(4q35.1)有顯著性差異(P＜0.01)。這兩個位點與孤獨癥的相關(guān)性在我國也是首次報道。我們計劃在 D4S392和D4S1535附近挑選基因，選擇SNP等高密度遺傳標(biāo)記，通過關(guān)聯(lián)分析、構(gòu)建單倍體型等方法，進一步篩選孤獨癥的易感基因。

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