絲裂霉素膀胱灌注對(duì)膀胱癌細(xì)胞端粒酶活性的影響

解放軍第四六三醫(yī)院泌尿外科(110042)劉興凱 姜泰茂 石岐興

劉冬燁 張 勇 張 樂(lè)

在我國(guó)，男性膀胱癌位居全身腫瘤的第8位，其發(fā)病率遠(yuǎn)較西方國(guó)家低［1］。臨床上膀胱癌以淺表性腫瘤為多見(jiàn)，約為70%～80%，淺表性膀胱癌患者手術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，3年內(nèi)復(fù)發(fā)率可達(dá)40%～70%［2］。膀胱癌采用化療藥物灌注是目前預(yù)防淺表性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的重要措施。由于端粒酶在腫瘤組織中較正常組織明顯高表達(dá)，因此具有腫瘤標(biāo)記物的作用，可用于惡性腫瘤的檢測(cè)［3-4］，因此可以選擇端粒酶作為評(píng)價(jià)化療藥物灌注效果的指標(biāo)。我院于2008年6月～2010年6月，采用絲裂霉素對(duì)一組膀胱移行細(xì)胞癌患者進(jìn)行術(shù)前膀胱灌注，通過(guò)檢測(cè)膀胱灌注前后腫瘤細(xì)胞端粒酶活性變化，從細(xì)胞和分子水平探討絲裂霉素對(duì)膀胱腫瘤的作用及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 膀胱移行上皮細(xì)胞癌患者50例，均經(jīng)病理證實(shí)。男29例，女21例。年齡35～86歲，平均70.4歲。臨床分期:T1期28例，T2期18例，T3期4例。細(xì)胞分級(jí):Ⅰ級(jí)26例，Ⅱ級(jí)17例，Ⅲ級(jí)7例。采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)30例，膀胱部分切除術(shù)13例，膀胱全切尿流改道7例。術(shù)前膀胱鏡檢查時(shí)留取腫瘤標(biāo)本。術(shù)前1周用絲裂霉素20mg經(jīng)導(dǎo)尿管緩慢注入膀胱，囑患者分別仰臥、左右側(cè)臥及俯臥，每15分鐘變換一次體位，保留藥物2小時(shí)。隔天灌注l次，共3次。手術(shù)留取腫瘤標(biāo)本，部分標(biāo)本離體后l小時(shí)內(nèi)液氮速凍，置-80℃冰箱保存(＜3個(gè)月)，部分標(biāo)本以10%甲醛固定、石蠟包埋。

1.2 研究方法 端粒酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司;PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)PE公司;酶標(biāo)檢測(cè)儀為美國(guó)Gene公司產(chǎn)品;冷凍高速離心機(jī)為日本HITACH公司。采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP-PCRELISA)對(duì)速凍膀胱癌組織的端粒酶活性進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定，操作方法簡(jiǎn)述如下:1)端粒酶提取:取膀胱癌組織標(biāo)本50mg在200μL預(yù)冷的裂解液中勻漿化，置碎冰中作用30分鐘，在4℃下16000r/min離心20分鐘，取上清液保存于-80℃?zhèn)溆谩?)TRAPPCR擴(kuò)增:取待測(cè)樣品50μg用25μLPCR反應(yīng)混合液，加入2μL蛋白提取液。再加入無(wú)菌雙蒸水至50μL，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行引物延伸與DNA擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下:引物延伸，25℃20分鐘;端粒酶滅活，94℃5分鐘;擴(kuò)增條件為:變性94℃30秒，復(fù)性50℃30秒，延伸72℃90秒，共30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10分鐘。3)產(chǎn)物雜交和ELISA檢測(cè):取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加入20μL變性試劑，在25℃下孵育10分鐘，再加入225μL雜交緩沖液混勻。取上述混合液，每孔100μL加入用親和素預(yù)包被的微量反應(yīng)板的各孔中。300r/min搖床37℃培養(yǎng)2小時(shí)。甩凈雜交液，250μL洗液每次30秒洗3次，甩干。每孔加入抗DIG-POD工作液100μL，在37℃下300r/min搖床培養(yǎng)30分鐘，甩凈孔內(nèi)液體，加入100μL TMB底物溶液，在室溫下顯色15分鐘。每孔加入100μL終止液，用酶標(biāo)分析儀測(cè)定標(biāo)本450nm波長(zhǎng)吸收值(A)。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 端粒酶活性測(cè)定:使用酶標(biāo)儀，測(cè)定加入終止液后30分鐘內(nèi)其在波長(zhǎng)450nm的吸收值，對(duì)照試劑盒內(nèi)標(biāo)的吸收值和控制模板的吸收值，得到相對(duì)定量數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

膀胱灌注前后膀胱癌組織的端粒酶活性分別為(12.84±3.53)和(3.88±1.03)，灌注后膀胱癌組織的端粒酶活性明顯降低，差異有顯著性(P＜0.05)。

將端粒酶活性降低作為所要分析的變量，將患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、病理分級(jí)、臨床分期、發(fā)作次數(shù)及預(yù)后情況分別作為分組變量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，膀胱灌注前后端粒酶活性降低情況與患者年齡、性別、腫瘤數(shù)量、病理分級(jí)、發(fā)作次數(shù)無(wú)關(guān)(P＞0.05)。端粒酶活性降低在腫瘤直徑＞3cm組與≤3cm組之間，臨床分期為T(mén)2～T3(浸潤(rùn)組)與Tis～T1(非浸潤(rùn)組)之間，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組與臨床痊愈組之間的差異有顯著性(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 絲裂霉素膀胱灌注前后腫瘤細(xì)胞端粒酶變化情況(，OD值)

表1 絲裂霉素膀胱灌注前后腫瘤細(xì)胞端粒酶變化情況(，OD值)

注:灌注前后端粒酶活性比較，P＜0.05;在腫瘤大小、臨床分期及預(yù)后情況組間比較端粒酶活性變化，P＜0.05。

3 討論

膀胱癌多為淺表性［5］，發(fā)病率占男性腫瘤的6%，病死率占2.5%，病因不明［6］。吸煙也是膀胱癌重要的致癌因素，其他如膀胱白斑、腺性膀胱炎、尿石等也可能是膀胱癌的誘發(fā)因素。膀胱癌臨床最常見(jiàn)的首發(fā)癥狀是肉眼血尿，血尿以間斷性、無(wú)痛性為主。膀胱癌的主要治療方法為外科手術(shù)。但術(shù)后易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)位置多不在原手術(shù)部位，因此預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)一般都采用膀胱內(nèi)藥物灌注治療［7］。絲裂霉素是抗生素類(lèi)抗腫瘤藥，為細(xì)胞周期非特異性藥物，膀胱內(nèi)極少吸收，藥物可直接作用于膀胱腫瘤細(xì)胞，與DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)形成交聯(lián)，也能直接作用破壞其DNA鏈，使之?dāng)嗔?，抑制DNA復(fù)制，并有烷化作用。有細(xì)胞毒作用，殺死腫瘤細(xì)胞，以阻止其復(fù)發(fā)。

端粒是位于染色體末端的DNA片段，具有穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)的功能。端粒酶是重新合成端粒DNA片段的一種核糖核酸蛋白酶，其能維持端粒的長(zhǎng)度和功能，使細(xì)胞永生化成為癌細(xì)胞。端粒酶活性的高低與腫瘤的分化程度有相關(guān)性。Hiyama等［8］報(bào)道，140例乳腺癌患者中端粒酶陰性者較端粒酶陽(yáng)性者病程分期早，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，腫瘤體積小。Al-banell等［9］對(duì)99例原發(fā)性肺癌患者的研究也顯示，腫瘤組織端粒酶活性與腫瘤的臨床生物學(xué)行為密切相關(guān)。劉興凱等［10］對(duì)腎上腺皮質(zhì)腫瘤中端粒酶的研究表明，端粒酶活性表達(dá)反映了腫瘤細(xì)胞的惡性行為，端粒酶活性檢測(cè)可望成為腎上腺皮質(zhì)腫瘤良惡性診斷的一種有用方法。Murakami等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，92%的惡性卵巢腫瘤呈端粒酶陽(yáng)性，且分化差的惡性腫瘤酶活性明顯高于其他腫瘤。研究證實(shí)，膀胱癌組織中端粒酶活性陽(yáng)性率達(dá)為86%～100%，而正常膀胱組織中均呈陰性［12-13］。

膀胱癌的復(fù)發(fā)［14］和轉(zhuǎn)移［15］一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題，而且常常伴隨復(fù)發(fā)的是級(jí)別的升高、浸潤(rùn)性的增強(qiáng)和轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)。所以如能早期、準(zhǔn)確地對(duì)有轉(zhuǎn)移可能的患者進(jìn)行判斷和監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的存在［16］，對(duì)治療方案的確立和對(duì)預(yù)后的評(píng)價(jià)都有積極的意義，就有可能幫助我們提高患者的5年生存率，延長(zhǎng)生命。由于端粒酶在膀胱腫瘤組織表達(dá)的普遍性與特異性，本實(shí)驗(yàn)選擇其作為監(jiān)測(cè)膀胱腫瘤治療效果及復(fù)發(fā)的指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)絲裂霉素膀胱灌注前后膀胱腫瘤組織的端粒酶活性，來(lái)觀察絲裂霉素對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷作用，證實(shí)了化療藥物可明顯抑制端粒酶的表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，監(jiān)測(cè)抗腫瘤前后端粒酶表達(dá)水平，可以為臨床預(yù)測(cè)膀胱灌注效果，合理選擇抗腫瘤藥物，減少不合適患者的藥物副作用和不必要的資源浪費(fèi)，為個(gè)體化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)分析，浸潤(rùn)性膀胱癌患者絲裂霉素膀胱灌注后端粒酶活性下降顯著低于非浸潤(rùn)性膀胱癌患者，其差異有顯著性，P＜0.05;腫瘤直徑＞3cm膀胱癌患者絲裂霉素膀胱灌注后端粒酶活性下降顯著低于腫瘤直徑≤3cm膀胱癌患者，差異也有顯著性，P＜0.05。結(jié)果說(shuō)明絲裂霉素膀胱灌注對(duì)膀胱腫瘤的殺傷效果與膀胱腫瘤大小和臨床分期有著明確的關(guān)系。從以往臨床資料和經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌多存在潛在和明確的轉(zhuǎn)移［17］，這也是其5年生存率一直很難提高的一個(gè)重要原因。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在浸潤(rùn)性膀胱癌患者中膀胱灌注的療效明顯低于非浸潤(rùn)性膀胱癌患者，該結(jié)果與肌層浸潤(rùn)性膀胱癌更易轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象有明顯相關(guān)性。當(dāng)膀胱腫瘤較大或浸潤(rùn)至肌層，絲裂霉素膀胱灌注時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)殺傷作用不完全，因此可能影響效果，表現(xiàn)在端粒酶活性下降幅度較低。

所有膀胱癌患者經(jīng)過(guò)3年隨訪，分為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組和臨床治愈組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組絲裂霉素膀胱灌注后端粒酶活性下降幅度較小;而臨床痊愈組端粒酶活性下降明顯，兩者差異有顯著性(P＜0.05)。這表明絲裂霉素敏感者預(yù)后佳，證明絲裂霉素對(duì)膀胱癌的治療及預(yù)防復(fù)發(fā)有顯著作用，能有效地抑制膀胱癌組織的細(xì)胞端粒酶活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［18］。對(duì)于絲裂霉素膀胱灌注后端粒酶活性下降小者，可加強(qiáng)術(shù)后檢查監(jiān)測(cè)，必要時(shí)行膀胱鏡檢查，若有復(fù)發(fā)早期發(fā)現(xiàn)。同時(shí)也可選擇其他化療藥物，如羥喜樹(shù)堿、阿霉素等膀胱灌注，或許會(huì)取得一定的療效。

［1］金美花，德偉林.聯(lián)合檢測(cè)尿HAase和NMP-22活性水平在膀胱癌診斷和手術(shù)后復(fù)發(fā)的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，16:947

［2］李振勇，徐求是.羥基喜樹(shù)堿膀胱灌注預(yù)防表淺性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2000，5:54

［3］Safont，MJ，Gil M，Sirera R，et al.The prognostic value of hTERT expression levels in advanced-stage colorectal cancer patients:a comparison between tissue and serum expression［J］.Clin Transl Oncol，2011，13(6):396

［4］Rahmati-Yamchi M，Zarghami N，Rahbani M，et al.Plasma leptin，hTERT gene expression，and anthropometric measures in obese and non-obese women with breast Cancer［J］.Breast Cancer，2011，5:27

［5］吳階平.吳階平泌尿外科學(xué)［M］.濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社，2004:952

［6］Hashimura T，Shirahase T，Inoue T，et a1.A randomized study ofprophylactic intravesical instillation of pirarubicin(THP)prior to transurethral resection of superficial bladder cancer［J］.Hin-yokika Kiyo，2005，51:439

［7］蘭衛(wèi)華，靳風(fēng)爍，王洛夫，等.卡介苗與絲裂霉素C膀胱灌注預(yù)防淺表性膀胱癌復(fù)發(fā)療效及毒性比較的Meta分析［J］.中華泌尿外科雜志，2006，27:29

［8］Hiyama E，Kageyama Y，Yonese J，et al.Telomerase activity in human breast tumors［J］.J Natl Cancer Inst，1996，88:116

［9］Albanell J，Lonardo F，Rusch V，et al.High telomerase activity in primary lung cancers［J］.JNatl Cancer Inst，1997，89:1609

［10］劉興凱，楊敬進(jìn)，袁勤民，等.端粒酶在腎上腺皮質(zhì)腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義「J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2003，28(6):558

［11］Murakami J，Nagai N，Ohama K，et al.Telomerase activity in ovarian tumors［J］.Cancer，1997，80(6):1085

［12］Rahat MA，Lahat N，Gazawi H，et al.Telomerase activity in patients with transitional cell carcinoma:apreliminary study［J］.Cancer，1999，85(4):919

［13］Wu WJ，Liu LT，Huang CH，et al.Telomerase activity in human bladder tumors and bladder washing specirnens［J］.Kaohsiung J Med Sci，2001，17(12):602

［14］Brems-Eskildsen AS，Zieger K，Toldbod H，et al.Prediction and di-agnosis of bladder cancer recurrence based on urinary content ofhTERT，SENP1，PPP1CA，and MCM5 transcripts［J］.BMC Cancer，2010，10:646

［15］Belair CD，Yeager TR，Lopez PM，et al.Telomerase activity:a biomark-er of cell proliferation，not malignant transformation［J］.Proc Natl AcadSci U SA，1997，94(25):13677

［16］汪彬哲，鄧曉芳，胡偉民.惡性腫瘤細(xì)胞血循環(huán)微轉(zhuǎn)移檢測(cè)進(jìn)展［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(7):1378

［17］Sexton WJ，Wiegand LR，Correa JJ，et al.Bladder cancer:a review ofnon-muscle invasive disease［J］.Cancer Control，2010，17(4):256

［18］宋永勝，楊威，符偉軍，等.抑制端粒酶活性誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的研究［J〕.中華泌尿外科雜志，2001，22(12):738