大孔樹脂純化甘草地上部分總黃酮的工藝

韓亞男,程新宇,侯俊玲,3＊,王文全,2,3,鄭巧云

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京100102;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京100193;3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心,北京100102)

甘草地上部分是甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的莖和葉。甘草地上部分的主要化學(xué)成分為黃酮類物質(zhì),盛花期甘草葉中總黃酮含量可達(dá)到5.64%[1]。研究[2-5]證明,甘草地上部分總黃酮具有和甘草根中總黃酮相類似的抗腫瘤、抗炎和抑制胃酸分泌過多等藥理作用,具有很大的開發(fā)潛力。但由于甘草地上部分含有大量的多糖、葉綠素和樹脂膠等雜質(zhì),致使甘草地上部分提取液中總黃酮的純度不高,影響進(jìn)一步開發(fā)。目前關(guān)于甘草地上部分總黃酮的提取工藝已有人研究,但是其純化方法尚未見報道。大孔樹脂法是純化黃酮等活性成分的簡易、高效的方法[6-7]。本實驗使用大孔樹脂,優(yōu)選了一套甘草地上部分總黃酮的純化工藝,為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 實驗材料

RE-Ⅱ旋蒸(上海亞榮生化儀器廠),SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科貿(mào)有限公司),pH100型筆試pH計(上海三信儀表廠),JBQ-100恒溫?fù)u床(常州普天儀器制造有限公司),SP-752型紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司),CP224C電子天平(奧豪斯儀器有限公司),PHS-2C型數(shù)字pH酸度計(上海精密科學(xué)儀器廠)。

甘草地上部分于2012年采于內(nèi)蒙古杭錦旗,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王文全教授鑒定,為甘草GLycyrrhiza uraLensis Fisch.的地上部分。蘆丁對照品(批號:120927,純度>98%,上海融禾醫(yī)藥科技有限公司),大孔樹脂購于河北滄州寶恩化工有限公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 樣品液的制備 秤取切制成4 cm小段的甘草地上部分20 kg,70%乙醇回流提取,95℃,2 h/次,3次。提取液濃縮至無醇味,取上清液備用。

2.2 測定方法[8-10]

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,用50%乙醇定容至100 mL容量瓶中,搖勻即得(每毫升溶液中含蘆丁0.2 mg)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.5,1.0,1.2,1.4,1.5,1.6,1.8,2.2,2.6,3.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,各加50%乙醇至2 mL;加入5%NaNO2溶液 0.5 mL,混勻,放置 6 min;加入 10%Al(NO3)3溶液 0.5 mL,混勻,放置 6 min;加入 4%NaOH溶液5 mL,再加水至 10 mL,搖勻,放置15 min。以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的試劑空白作為參比溶液。用1 cm比色皿,在500 nm波長處測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度A為橫坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),得回歸方程Y=0.079X+0.001,R2=0.999,線性范圍1～60 mg/mL。

2.2.3 樣品的測定 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制定的方法進(jìn)行樣品的測定。

2.3 大孔樹脂型號靜態(tài)篩選

2.3.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附率的測定 精密秤取預(yù)處理好的6種大孔樹脂各10 g(濾紙吸干樹脂表面的水分)至50 mL具塞錐形瓶中,分別加入上清液溶液30mL(總黃酮濃度為2.03 mg/mL),置于搖床上使其充分吸附(37℃,80 r/min),10 h后分別測定各錐形瓶上清液中的總黃酮濃度,計算各型號樹脂的靜態(tài)吸附率。

靜態(tài)吸附率=(吸附前總黃酮質(zhì)量濃度-吸附后總黃酮質(zhì)量濃度)/吸附前總黃酮質(zhì)量濃度×100%

2.3.2 大孔樹脂靜態(tài)解吸附率的測定 將上述吸附飽和的樹脂用濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液,置于錐形瓶中,準(zhǔn)確加入70%乙醇30 mL,置于恒溫?fù)u床中(37℃ ,80 r/min),振搖10 h,充分洗脫,過濾,得濾液,測定總黃酮含量,計算各大孔吸附樹脂的靜態(tài)解吸附率。

靜態(tài)解吸附率=解吸附后總黃酮質(zhì)量濃度/(吸附前總黃酮質(zhì)量濃度-吸附后總黃酮質(zhì)量濃度)×100%

2.3.3 大孔樹脂靜態(tài)富集總黃酮的回收率 甘草地上部分總黃酮經(jīng)過大孔樹脂吸附和解吸附的過程,過程中都有總黃酮損失,以總黃酮回收率能全面的反應(yīng)大孔樹脂的吸附性能。

靜態(tài)富集總黃酮回收率=靜態(tài)吸附率×靜態(tài)解吸附率

實驗比較了6種不同型號大孔樹脂對甘草地上部分總黃酮的吸附性能,結(jié)果見表1。

表1 不同型號大孔樹脂對總黃酮的吸附性能(±s,n=3)

表1 不同型號大孔樹脂對總黃酮的吸附性能(±s,n=3)

樹脂型號 吸附后質(zhì)量濃度/(mg/mL) 吸附率/% 洗脫液質(zhì)量濃度/(mg/mL) 解吸附率/% 總黃酮回收率/%HPD-BJQH 0.29±0.03 85.93 1.57±0.04 89.77 77.14 HPD-450 0.34±0.07 83.25 1.56±0.04 92.23 76.78 AB-8 0.26±0.07 87.11 1.56±0.02 88.33 76.94 HPD-417 0.43±0.07 78.64 1.39±0.04 87.05 68.46 DM130 0.28±0.09 86.43 1.57±0.05 89.39 77.27 HPD-600 0.25±0.07 87.72 1.51±0.08 74.42 65.28

由表1可知,樹脂HPD-600和AB-8這2種樹脂的吸附率較高,HPD-450和HPD-BJQH這2種樹脂的解吸附率較高,但綜合比較6種樹脂的總黃酮回收率,DM130、HPD-BJQH這2種型號樹脂對甘草地上總黃酮表現(xiàn)出較好的吸附性能,選擇這2種型號樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附性能考察。

2.4 大孔樹脂型號動態(tài)篩選

2.4.1 泄露曲線的繪制 精密秤取DM130和HPDBJQH樹脂各5 g(用濾紙吸干其表面水分),濕法裝柱(內(nèi)徑為 1 cm,1 BV=8.7 mL)。上樣液濃度為2.42 mg/mL,上樣流速為1 mL/min,流出液每10 mL為一個單位,繪制泄露曲線。見圖1。

2.4.2 動態(tài)洗脫 樹脂飽和后靜置過夜,充分吸附;4 BV水除雜,70%乙醇洗脫至洗脫液無顏色;收集洗脫液,70%乙醇定容至50 mL,測定洗脫液中總黃酮的濃度。

由圖1可知,DM130樹脂在上樣量達(dá)到50 mL時,開始出現(xiàn)大量的黃酮泄露,在上樣量為120 mL時,樹脂基本吸附飽和。HPD-BJQH樹脂在上樣量達(dá)到80 mL時,黃酮開始大量泄露,在上樣量為170 mL時,樹脂吸附飽和,流出液總黃酮濃度和上樣液總黃酮濃度很相近。通過UV測定二者洗脫液總黃酮濃度得知,DM130洗脫液中的總黃酮質(zhì)量為187.75 mg;HPD-BJQH洗脫液中的總黃酮質(zhì)量為231.99 mg。

圖1 DM130和HPD-BJQH樹脂的黃酮泄露曲線

結(jié)合樹脂靜態(tài)吸附性能,綜合考慮,確定樹脂型號為HPD-BJQH。根據(jù)泄露曲線顯示,上樣濃度為2.42 mg/mL時,5 g樹脂上樣總黃酮量為193.6 mg較合適。

2.5 大孔樹脂工藝的正交試驗優(yōu)化

2.5.1 正交實驗表的選用 固定每份樹脂的裝柱量,濕法裝柱,根據(jù)影響大孔樹脂吸附性能的因素采用L16(45),選擇上樣濃度、上樣液pH值、上樣速度和洗脫溶劑為考察因素,每個因素選取4個水平,以總黃酮的回收率為指標(biāo),對大孔樹脂純化總黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)選。因素水平見表2。

2.5.2 正交試驗及結(jié)果分析 取甘草地上部分提取濃縮液分別稀釋15倍(2.93mg/mL),20倍(2.15 mg/mL),25倍(1.86 mg/mL),40倍(1.15 mg/mL),各180,240,300,480 mL,均分為 4份。按L16(45)正交表實驗,將樣品溶液上樣到含有等質(zhì)量樹脂(4 g)的相同規(guī)格的樹脂柱上(內(nèi)徑為 1 cm,徑高比為1∶8,BV=7 mL)。上樣完成后過夜充分吸附,4 BV水,流速4 BV/h除雜,見表3。按照上述正交試驗表進(jìn)行洗脫,洗脫速度為2 BV/h,體積為5 BV。收集洗脫液,50%乙醇定容至50 mL,測定洗脫液中的總黃酮含量,計算總黃酮回收率。

表2 大孔樹脂純化總黃酮因素表

總黃酮回收率=洗脫液中的總黃酮質(zhì)量/上樣液中的總黃酮質(zhì)量×100%

通過實驗結(jié)果的極差分析,可以看出,對結(jié)果影響的大小程度為:洗脫濃度>上樣濃度>上樣pH>上樣速度>洗脫速度。甘草地上總黃酮純化工藝最佳組合為A2B2C2D3,即上樣濃度為2.15 mg/mL,上樣速度為3 BV/h,pH值為5;70%乙醇洗脫。方差分析顯示上樣濃度,上樣速度,上樣液pH值以及洗脫液濃度均對結(jié)果有顯著影響。

2.6 洗脫劑用量的考察 秤取HPD-BJQH樹脂4 g,濕法裝柱,按照正交試驗考察的最優(yōu)工藝進(jìn)行上樣,上樣完成后,靜置2 h,充分吸附,然后用70%乙醇,2 BV/h洗脫,每1/2 BV(3.5mL)為一單位收集洗脫液,測定其中的總黃酮濃度,繪制動態(tài)洗脫曲線。見圖2。

表3 L16(45)正交實驗結(jié)果

圖2 HPD-BJQH樹脂的動態(tài)洗脫曲線

表4 純化前后總黃酮的純度

由圖2可知,當(dāng)洗脫液用量為3 BV時,大部分黃酮被洗出,故洗脫體積定為3 BV。

2.7 驗證試驗 秤取HPD-BJQH樹脂4 g,3份,濕法裝柱,按照上述優(yōu)化條件純化甘草地上部分的總黃酮,收集所有洗脫液,蒸干,得總黃酮浸膏。精密秤取一定質(zhì)量浸膏,50%乙醇定容至50 mL,測定溶液中總黃酮的濃度,計算純化總黃酮的純度,結(jié)果見表4。

3 討論

本實驗針對甘草地上總黃酮首次進(jìn)行了富集純化工藝的研究。針對黃酮類成分,筆者選擇了具有代表性的極性(HPD-600)、中極性(HPD-450)、弱極性(AB-8、DM130、HPD-BJQH)以及氫鍵吸附(HPD-417)性質(zhì)的大孔樹脂進(jìn)行型號篩選,全面考察了不同類別大孔樹脂對甘草地上部分的適用性,試驗結(jié)果穩(wěn)定可信。

孔樹脂富集純化黃酮分為吸附和洗脫2個步驟,本實驗以最后總黃酮回收率為考察指標(biāo),把影響富集純化效果的所有條件都放在一個正交試驗中進(jìn)行優(yōu)化。避免了單因素考察產(chǎn)生的誤差,使試驗具有整體性和嚴(yán)謹(jǐn)性。經(jīng)過本工藝純化后的總黃酮純度由原來的9.68%提升到36.11%,驗證試驗證明,該工藝穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,能較好的純化甘草地上部分總黃酮。隨著甘草地上部分的進(jìn)一步開發(fā),該工藝可以應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)上。

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