海產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉雪飛，申越，任園園，張德福，李秀霞，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州 121013）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，V.p）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，是海水和江河口環(huán)境中的固有微生物。它能通過(guò)食物和水引起人類的疾病，同時(shí)也對(duì)生長(zhǎng)在海水和江河口環(huán)境中的動(dòng)物有致病性，包括養(yǎng)殖的動(dòng)物[1]。V.p廣泛存在于各種海產(chǎn)品中，魚(yú)體帶菌率約為 20%～90%[2]。一般情況下，海產(chǎn)品體內(nèi)外均帶菌，但當(dāng)海產(chǎn)品作為食品被捕撈后，體外菌體迅速死亡，體內(nèi)的副溶血性弧菌會(huì)很快感染整個(gè)海產(chǎn)品。我國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)顯示，V.p是上報(bào)的食源性疾病暴發(fā)事件的首要致病因素。該菌在沿海地區(qū)已成為引起細(xì)菌性食物中毒的首要食源性致病菌[3,4]。其導(dǎo)致1996年以來(lái)世界范圍沿海國(guó)家約50%以上細(xì)菌性食物中毒事件的爆發(fā)[5]。中國(guó)水產(chǎn)品出口國(guó)主要集中在日本、美國(guó)、歐盟和韓國(guó)，僅這四大市場(chǎng)就占到了總出口量的85%左右[6]。而這四個(gè)國(guó)家對(duì)進(jìn)口水產(chǎn)品的安全要求中都明確規(guī)定副溶血性弧菌等致病菌一律不得檢出。對(duì)原產(chǎn)自中國(guó)的進(jìn)口水產(chǎn)品強(qiáng)制性要求進(jìn)行V.p檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)產(chǎn)品將被就地銷毀，這給我國(guó)水產(chǎn)品的出口設(shè)置了貿(mào)易壁壘。

現(xiàn)階段的研究認(rèn)為，副溶血性弧菌產(chǎn)生的致病因子有多種，包括溶血素、尿素酶、粘附因子、第三分泌系統(tǒng)[7]等。研究較多的是溶血素類，其中耐熱直接溶血毒素（thenmostable direct hemolysin,TDH）和耐熱相關(guān)直接溶血毒素（TDH-related hemolysin, TRH）被認(rèn)為是 V.p 的主要致病因子，分別由相應(yīng)的tdh和trh基因編碼。但其致病的詳細(xì)機(jī)理尚不明確[4]。為了減少我國(guó)食品在進(jìn)出口貿(mào)易中的經(jīng)濟(jì)損失，消除消費(fèi)者的食品安全隱患，本文就現(xiàn)下流行的檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié)歸納，以便為檢測(cè)方法的應(yīng)用和發(fā)展提供參考。

1 傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)法

傳統(tǒng)培養(yǎng)法即國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等，被認(rèn)為是食品檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其最大的缺點(diǎn)是周期長(zhǎng)（4～7d）、工作量大，但卻是最經(jīng)典的檢測(cè)方法，可作為其他方法的驗(yàn)證。

目前認(rèn)為微生物在自然界存在 4種生理狀態(tài)：一是可培養(yǎng)的活菌，二是活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC），三是具有完整結(jié)構(gòu)但無(wú)生物活性的死菌（Ghosts），四是細(xì)胞膜損傷死菌（Membrane compomised）[8]。傳統(tǒng)培養(yǎng)法只能檢出第一種，而進(jìn)入VBNC的V.p在添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（25℃）和升溫（37℃）條件下可以復(fù)蘇，并檢測(cè)出與標(biāo)準(zhǔn)菌株一致的毒力基因[9]。加之樣本中的雜菌會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，從而使在食品樣品上污染數(shù)量較少的V.p出現(xiàn)漏檢的情況。例如竇勇[10]在利用ELISA法進(jìn)行V.p檢測(cè)時(shí)以國(guó)標(biāo)法作為對(duì)照，實(shí)物樣品中V.p低于105MPN/g時(shí)國(guó)標(biāo)法就無(wú)法檢出。

2 顯色培養(yǎng)基法

顯色培養(yǎng)基是在生化反應(yīng)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的技術(shù)，利用鑒別性培養(yǎng)基的原理，向分離培養(yǎng)基中加入細(xì)菌特異性酶的顯色底物，以達(dá)到只須用肉眼辨別顏色就能方便地從近似的菌落中找出目的菌落的目的。檢測(cè)結(jié)果直觀，易于觀察，減少了進(jìn)行純培養(yǎng)和生化鑒定的步驟，大大提高了檢測(cè)效率[11]。且具有成本低、特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測(cè)快速、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外微生物檢測(cè)的一個(gè)主要發(fā)展方向。

傳統(tǒng)檢測(cè)方法中，國(guó)內(nèi)外最常用的分離平板是硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖 （TCBS） 瓊脂，該培養(yǎng)基針對(duì)V.p不發(fā)酵蔗糖的特點(diǎn)并結(jié)合酸堿指示劑進(jìn)行顯色，使V.p的菌落呈現(xiàn)綠色。但是TCBS不能有效區(qū)分生化特征相似的V.p、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）等，造成檢測(cè)結(jié)果的不確定性。當(dāng)有發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸的弧菌存在時(shí)，黃色菌落由于顏色擴(kuò)散往往能覆蓋綠色菌落，使V.p不易辨認(rèn)[11-12]。因此許多國(guó)家都在致力于顯色培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)[11-15]，以彌補(bǔ)TCBS的缺陷。2008年我國(guó)修訂了食品中副溶血性弧菌的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[16]，首次將顯色培養(yǎng)基引入我國(guó)的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。同年，張淑紅等研制出了V.p顯色培養(yǎng)基HKC vibrio，該培養(yǎng)基比TCBS具有更高的檢測(cè)效率，可直接對(duì)V.p進(jìn)行分離鑒定[11]。2010年，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司開(kāi)發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的雙酶底物復(fù)合顯色培養(yǎng)基（HKMVPM），與國(guó)外的同類產(chǎn)品KHVPM和TCBS進(jìn)行比較，結(jié)果顯示對(duì)天然污染樣品的V.p分離率由高到低的順序?yàn)镠KMVPM >KHVPM > TCBS[14]。顯色培養(yǎng)基具有省時(shí)、低成本、高檢出等特點(diǎn)，適合我國(guó)國(guó)情，必將會(huì)促進(jìn)該項(xiàng)技術(shù)在我國(guó)得到廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。

3 免疫學(xué)方法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

ELISA是最常見(jiàn)的免疫學(xué)檢測(cè)方法，該方法實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞水平上對(duì)抗原或抗體的示蹤，或在微克、甚至納克水平上對(duì)抗原（致病菌）或抗體的定量。1993年，Romesranel B等人[17]建立了海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的ELISA檢測(cè)方法。在國(guó)內(nèi)外的學(xué)者[18-21]對(duì)ELISA法逐漸改進(jìn)的基礎(chǔ)上，此項(xiàng)技術(shù)已日趨完善，現(xiàn)在市場(chǎng)上已經(jīng)有了商品化的試劑盒產(chǎn)品，操作簡(jiǎn)單，特異性好，靈敏度高，并已廣泛應(yīng)用于病原性海洋弧菌的快速檢測(cè)。

Kumar BK[18]等人的研究結(jié)果顯示，樣品被增菌16小時(shí)之后ELISA法可以檢測(cè)到103以上的V.p細(xì)胞，較PCR法低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，但是通過(guò)檢測(cè)分泌蛋白可以排除死細(xì)胞的干擾。而Sakata J[19]等人得出的結(jié)果是ELISA法可以檢測(cè)少于100 MPN/g的V.p細(xì)胞，前提是需要進(jìn)行前期的篩選，但總的檢測(cè)時(shí)間可以在24h內(nèi)完成。

3.2 免疫層析試紙條技術(shù)

該技術(shù)是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來(lái)的，因其具有簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，可用于基層單位對(duì)各種食源致病菌的快速篩查檢測(cè)。依據(jù)反應(yīng)時(shí)抗原與抗體結(jié)合方式的不同，主要可將其分為雙抗夾心免疫層析法和競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法兩類[20]。雙抗夾心免疫層析法是目前免疫層析試紙條檢測(cè)食源性致病菌的主要方法。與競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法相比，雙抗夾心免疫層析法主要用于大分子蛋白質(zhì)、病毒、致病菌等帶有多個(gè)抗原表位的大分子抗原的檢測(cè)。而對(duì)獸藥殘留、違禁藥物等小分子抗原檢測(cè)中則多采用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法[20]。免疫學(xué)方法是以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)對(duì)待檢物進(jìn)行檢測(cè)，如何提高抗原抗體的親和力是提高免疫學(xué)檢測(cè)方法的關(guān)鍵，也是其研究發(fā)展的方向之一。我國(guó)學(xué)者孔繁德等開(kāi)展了這方面的研究[21]，試驗(yàn)過(guò)程僅需5～15min，對(duì)V.p的最低檢測(cè)量為104CFU/mL。這種試紙條操作簡(jiǎn)便快速，特別適于基層的養(yǎng)殖部門(mén)和檢查部門(mén)應(yīng)用。

4 分子生物學(xué)方法

4.1 PCR技術(shù)

PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是Kary Mullis在1985年時(shí)發(fā)明的一種在體外擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)方法。該方法一經(jīng)問(wèn)世,即引發(fā)國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注，主要原因是其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、對(duì)標(biāo)本的純度要求低、不需要分離細(xì)菌等特點(diǎn)，因此在國(guó)內(nèi)外被研究人員廣泛應(yīng)用于V.p的檢測(cè)。PCR反應(yīng)的成分主要有六種即引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、模板、Mg2+和反應(yīng)緩沖液。

4.1.1 常規(guī)PCR

在檢測(cè)致病性 V.p時(shí)，常選擇引起致病性的毒力基因來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。這些毒力基因主要包括tdh基因[22-24]、trh基因[23-24]、毒力操縱子調(diào)節(jié)基因toxR[24-25]、編碼促旋酶的gyrB基因[26-28]等。日本的標(biāo)準(zhǔn)推薦使用tdh和trh基因進(jìn)行PCR檢測(cè)。但是，tdh基因、trh基因都不是獨(dú)立基因，造成它們與其他致病菌的毒素基因同源性很高，而且不是所有的V.p都含有 tdh 或 trh 基因，因此應(yīng)用tdh或trh進(jìn)行PCR檢測(cè)存在很大局限性。如果要進(jìn)行副溶血性弧菌的預(yù)防性檢測(cè)，則推薦采用其屬特異性基因tlh來(lái)設(shè)計(jì)引物。如王豪[29]和劉琦[30]等，其針對(duì)tlh基因設(shè)計(jì)引物對(duì)V.p檢測(cè)，靈敏度為102～103CFU/ml，檢測(cè)周期10h[30]。

4.1.2 多重PCR

多重PCR在致病菌檢測(cè)時(shí)可同時(shí)檢測(cè)多種致病菌，與單個(gè)PCR相比減輕了很大的工作量。當(dāng)選用副溶血性弧菌種特異性基因tlh與其毒力基因進(jìn)行多重PCR檢測(cè)時(shí)，不但可以一次將V.p檢出，而且可同時(shí)判斷其檢測(cè)到的V.p的致病性，這使該方法具有非常大的發(fā)展空間。

在日本、美國(guó)、加拿大等國(guó)的食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)都推薦采用多重PCR法檢測(cè)副溶血性弧菌，不同的只是他們針對(duì)的基因不同。這三個(gè)國(guó)家推薦采用多重PCR法檢測(cè)副溶血性弧菌的基因分別為tdh和trh基因（日本）、tlh、tdh和trh基因（美國(guó)）、tdh、trh和R72H基因（加拿大）。加拿大食品檢驗(yàn)屬認(rèn)為R72H基因不僅是V.p的毒力基因，而且具有高度的序列保守性，它還能將近緣的副溶血性弧菌和溶藻弧菌加以區(qū)分[31-36]。Rosec JP[35]等對(duì)不同基因設(shè)計(jì)引物來(lái)檢測(cè)V.p時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同的基因引物檢測(cè)限有所不同。針對(duì)toxR 基因的擴(kuò)增檢測(cè)范圍是 7～24 pg /反應(yīng)管（提純的DNA），而針對(duì)R72H基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)檢測(cè)范圍變成了0.7 pg～10.6 ng/反應(yīng)管（提純的DNA）。

由于多重PCR體系更復(fù)雜，與簡(jiǎn)單PCR相比需要花費(fèi)更多的時(shí)間去摸索穩(wěn)定的體系，以及更要避免引物之間形成二聚體，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR），是通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化。按照使用的熒光物質(zhì)不同，將其分為探針類和熒光染料類兩種。Robert-Pillot A等采用了熒光探針對(duì)蝦內(nèi)污染的V.p進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)對(duì)象是提純的DNA時(shí)，200 pg以上的含量都可以檢測(cè)到。而在對(duì)對(duì)蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，6h的前增菌可以將檢測(cè)限提高3個(gè)數(shù)量級(jí)[37]。熒光染料的特異性沒(méi)有探針?lè)ǜ?，但是其價(jià)格相對(duì)低廉而且操作起來(lái)簡(jiǎn)單易行，因此有很多實(shí)驗(yàn)室一直沿用該方法。例如Kang MH等就運(yùn)用熒光染料SYBR GreenⅠ對(duì)V.p 進(jìn)行了檢測(cè)，而且他們將定量PCR反應(yīng)由3步縮短成了2步，PCR反應(yīng)時(shí)間在6 min 之內(nèi)就可以完成，檢出限為100 fg的DNA[38]。

PCR檢測(cè)方法本身存在一定的缺陷：一是細(xì)胞死后其DNA不能快速降解，導(dǎo)致環(huán)境DNA污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；二是食品中很可能存在對(duì)PCR反應(yīng)起抑制作用的物質(zhì)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果；三是這種分子檢測(cè)方法需要價(jià)格昂貴的PCR儀，不適于基層推廣應(yīng)用。在運(yùn)用PCR方法進(jìn)行實(shí)物檢測(cè)過(guò)程中，要注意避免樣品中的外源DNA污染和雜質(zhì)對(duì)PCR反應(yīng)的干擾作用[31,39]。

4.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)

LAMP（1oop—mediated isothermal amplification）是 2000 年時(shí)由日本學(xué)者 Notomi 等發(fā)明的新型核酸體外擴(kuò)增技術(shù)[40]。由于該方法不需要使用昂貴的PCR儀，檢測(cè)成本低，反應(yīng)的時(shí)間較PCR進(jìn)一步縮短（1h以內(nèi)），特異性更強(qiáng)，因此該方法被越來(lái)越多的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所采用[41-43]。因其易于在基層推廣應(yīng)用，有望成為未來(lái)的常規(guī)檢測(cè)手段。

LAMP與PCR相比除了酶有變化外，其反應(yīng)成分多了兩條內(nèi)引物，因此體系更復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性相對(duì)較差，需要實(shí)驗(yàn)者不斷摸索穩(wěn)定的反應(yīng)體系，才能對(duì)實(shí)際樣品中的副溶血性弧菌等致病菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀用肉眼不易觀察，需采用專門(mén)的實(shí)時(shí)濁度儀跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。針對(duì)以上的缺點(diǎn)，劉威[44]和Wang X[45]將熒光染料羥基萘酚藍(lán)（HNB）與LAMP相結(jié)合，通過(guò)觀察擴(kuò)增后反應(yīng)管的顏色就可對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定，使操作更加簡(jiǎn)便，應(yīng)用前景廣闊。劉威等報(bào)道的LAMP 方法的最低檢出限為 9.74 pg/ L，比PCR 方法的最低檢出限高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，反應(yīng)可以在50 min內(nèi)完成[44]。如果在反應(yīng)體系中添加環(huán)引物，可以縮短一半的反應(yīng)時(shí)間。

4.3 其他分子生物學(xué)檢測(cè)方法

除了前面提到的方法外，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)還包括DNA雜交法、DNA指紋圖譜技術(shù)。在檢測(cè)副溶血性弧菌時(shí)，DNA雜交法常常針對(duì)tdh等毒力基因設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸探針，該探針需要預(yù)先附著放射性物質(zhì)，當(dāng)探針與靶序列結(jié)合后，通過(guò)放射性自顯影進(jìn)行結(jié)果觀察，以達(dá)到指示目標(biāo)基因的目的。

DNA指紋圖譜是利用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行特定位點(diǎn)的切割，從而獲得不同長(zhǎng)度的片段，再通過(guò)電泳將其分散而形成獨(dú)特的條帶。目前對(duì)副溶血性弧菌的 DNA指紋研究分別針對(duì)染色體DNA和質(zhì)粒DNA。指紋圖譜既能區(qū)分不同血清型又能對(duì)不同的副溶血性弧菌克隆進(jìn)行鑒別，因此，該項(xiàng)技術(shù)在分子流行病學(xué)研究中應(yīng)用非常廣泛[31]。

5 其他方法

Raghunath P等[46]對(duì)V.p的富集方法進(jìn)行了改進(jìn)，運(yùn)用其研制的富集培養(yǎng)基sodium taurocholate（ST broth）與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的堿性蛋白胨水（APW）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果無(wú)論是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法還是PCR檢測(cè)，ST的檢出率都明顯高于APW。陳偉鑫等[47]在GB / T4789.7－2003的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，通過(guò)同時(shí)用改進(jìn)法和國(guó)標(biāo)法對(duì)采集的193 件食品樣品進(jìn)行副溶血性弧菌檢測(cè)，改進(jìn)法檢出率5.70%高于國(guó)標(biāo)法的0.52%，兩者有顯著性差異。

另外，PCR方法可與其他方法相結(jié)合演變出許多新方法。如免疫捕捉PCR（IC-PCR）、膜過(guò)濾PCR和免疫磁珠PCR（IMS-PCR）等。還有的研究者利用特異的噬菌體對(duì)特定細(xì)菌有裂解的功能，從而對(duì)致病菌進(jìn)行鑒定。但實(shí)驗(yàn)前需要對(duì)噬菌體進(jìn)行篩選，而且必須同時(shí)進(jìn)行生化鑒定才能確認(rèn)[31]。

6 結(jié)語(yǔ)

隨著副溶血性弧菌引起的食源性疾病數(shù)量的增加、范圍的擴(kuò)大，以及國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其研究的不斷深入，其檢測(cè)技術(shù)必將會(huì)得到不斷改進(jìn)和發(fā)展。而快速、高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是今后的研究方向。在具體檢測(cè)中，首先應(yīng)該明確各種分析檢測(cè)方法的適用范圍及精確度，根據(jù)不同的研究目的采用不同的方法，或?qū)追N方法綜合運(yùn)用，以避免方法本身不可避免的局限性，從而獲得更加全面和更加可靠的信息。

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