小RNA干擾PCBP2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中對P53相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和對細(xì)胞增殖的影響

韓 為，陰 彬，彭小忠

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

研究論文

小RNA干擾PCBP2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中
對P53相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和對細(xì)胞增殖的影響

韓 為，陰 彬，彭小忠*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系
醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

目的探索多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白2(PCBP2)表達(dá)下調(diào)對相關(guān)基因和膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。方法3株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(T98G、U87MG和U251)各分為2組，分別轉(zhuǎn)入特異性靶向PCBP2基因的小干擾RNA(siRNA)和對照siRNA，用Western blot法檢測siRNA對PCBP2蛋白的抑制效果及對P53蛋白和它的兩個靶基因PUMA和BAX的表達(dá)影響，同時檢測P53共調(diào)節(jié)因子FHL2和同家族成員FHL1表達(dá)變化。用生物素pull-down分析PCBP2是否和FHL家族成員mRNA結(jié)合。用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)摻入法檢測細(xì)胞增殖能力，Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡率。結(jié)果PCBP2 siRNA轉(zhuǎn)染這3株細(xì)胞后使PCBP2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(Plt;0.05)；增加P53及它的靶基因PUMA和BAX的蛋白表達(dá)(Plt;0.05)；抑制FHL2蛋白(Plt;0.05)，但并不結(jié)合其mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)；BrdU陽性細(xì)胞減少(Plt;0.05)；Hoechst染色陽性細(xì)胞增多(Plt;0.05)。結(jié)論抑制PCBP2表達(dá)可以增強膠質(zhì)瘤細(xì)胞中P53通路活性，并減弱細(xì)胞增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

RNA干擾；多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白2；P53；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的40%～60%，屬國內(nèi)十大高發(fā)腫瘤之一，在歐美國家發(fā)病率更高，極大影響患者的健康和生活質(zhì)量[1]。膠質(zhì)瘤的發(fā)生機制迄今尚不清楚，相關(guān)研究表明，P53基因的突變、缺失與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是導(dǎo)致該瘤發(fā)生的重要事件[2]。P53是一個廣泛表達(dá)與真核細(xì)胞中的抑癌基因，并且它作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)上百種功能各異的靶基因[3]。4個半LIM結(jié)構(gòu)域(four-and-a-half-LIM domain, FHL)家族成員FHL2可以作為共調(diào)節(jié)因子與P53一起調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生理作用[4]。研究顯示，多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白2[poly(C) binding protein 2, PCBP2]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并且可以結(jié)合FHL家族另一成員FHL3 mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)，負(fù)性調(diào)節(jié)其mRNA穩(wěn)定性，進(jìn)而影響FHL3基因表達(dá)[5]。本研究利用小干擾RNA(siRNA)在3種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中敲低PCBP2，檢測P53通路蛋白和FHL家族其他蛋白的表達(dá)變化，并觀察了抑制PCBP2表達(dá)對細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

T98G和U87MG細(xì)胞(ATCC)；U251細(xì)胞、胰蛋白酶、雙抗(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)；MEM/EBSS和胎牛血清(Gibco公司)；PCBP2 siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)序列為：5′-GGCCTATACCATTCAAGGA-3′；用于Biotin pull-down的探針引物(英駿生物技術(shù)有限公司)序列如下：FHL1-3′A 上游：5′-GGAATTCAGGGGCTCCT GTCCTGTAAA-3′，下游：5′-CGGGATCCCTGCAACTC TTGCATGTCGT-3′；FHL1-3′B 上游：5′-GGAATTCCA TCAGAACTCTGCCCTTCC-3′，下游：5′-CGGGATCCT CAGCACTGCAGGAACATCT-3′；FHL1-3′C上游：5′-GG AATTCTCTAGAGGGGGAGTTGAGCA-3′，下游：5′-C GGGATCCAGGCATCAGCTTCTCTAACCA-3′；FHL2-3′UTR 上游：5′-GGAATTCTTCTTTCTCACCCAGGCA AT-3′，下游：5′-CGGGATCCGGTTTAGACTTGACGC AACG-3′；FHL3-3′A 上游：5′-CGGGATCCCAGGACT GTGGCTCCTTTTC-3′，下游：5′-CCCAAGCTTGCACC CATAGGAGACCTGAA-3′；FHL3-3′B上游：5′-CGGG ATCCGGACTGTTCTCAGGCTTGAC-3′，下游：5′-CC CAAGCTTCACACCGCTTTATTGCAG AATC-3′；Lipofectamin 2000、Opti-MEM(Invitrogen公司)；β-actin抗體(Sigma公司)；P53抗體(sc-25373)、FHL2抗體(sc-52667)(Santa Cruz公司)；PUMA抗體(4976s)、BAX(2772s)(Cell Signaling公司)；PCBP2抗體(ARP40568)(北京奧維亞生物技術(shù)有限公司)；FHL1抗體(10991-1-AP)(Proteintech公司)；Streptavidin Sepharose珠子(GE公司)； Biotin RNA Labeling Mix和Mini Quick Spin Column(Roche公司)；pGEM-3Zf載體(Promega公司)；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；胞質(zhì)胞核分步提取試劑盒(Thermo公司)；細(xì)胞凋亡-Hoechst染色盒(33258，碧云天公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G、U87MG和U251培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1∶2細(xì)胞每2～3 d傳代1次。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前1天，用胰蛋白酶進(jìn)行消化以收獲對數(shù)期生長的細(xì)胞，計數(shù)后以(1～3)×105個/mL接種到相應(yīng)的孔板中，培養(yǎng)過夜至細(xì)胞達(dá)到50%～70% 匯合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前1～2 h更換無雙抗的新鮮培養(yǎng)基；配制轉(zhuǎn)染體系(以12孔板為例)：在兩個無菌的1.5 mL離心管中各加入100 μL opti-MEM培養(yǎng)液。在其中一個加入100 pmol siRNA，另一個加入2 μL Lipofectamine 2000，單獨混勻后室溫放置5 min，然后將兩管溶液輕輕混合均勻，室溫放置20 min；將混合液逐滴加入培養(yǎng)板中，輕輕混勻。孵箱中培養(yǎng)4～6 h后更換含雙抗的新鮮培養(yǎng)基。48 h后根據(jù)實驗需要觀察或收集細(xì)胞。

1.4蛋白提取和Westernblot檢測PCBP2和P53相關(guān)基因表達(dá)

[6]。

1.5 體外轉(zhuǎn)錄生物素標(biāo)記的RNA探針

將測序正確的FHL1的3′UTR上A(3′A)、B(3′B)、C(3′C)、FHL2的3′UTR、FHL3的3′UTR上A(3′A)和B(3′B)分別連入pGEM-3Zf載體中，將載體單酶切線性化作為DNA模板。然后按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)液(加入Biotin RNA Labeling Mix 2 μL)，37 ℃反應(yīng)60 min。取Mini Quick Spin Column純化 RNA探針。

1.6生物素pull-down分析PCBP2與FHL家族成員3′UTR的相互作用

按照胞質(zhì)胞核分步提取試劑盒說明書分別提取胞質(zhì)蛋白和核蛋白，合并作為總蛋白(input)進(jìn)行分析。后續(xù)步驟見參考文獻(xiàn)[5]。

1.7 BrdU摻入檢測細(xì)胞增殖能力

見參考文獻(xiàn)[6]。

1.8 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡

按照碧云天細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒說明書對細(xì)胞進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1敲低PCBP2對P53蛋白和其靶基因表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染PCBP2 siRNA到T98G、U87MG和U251這3株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，可以明顯抑制PCBP2蛋白的表達(dá)(圖1A)。PCBP2表達(dá)下調(diào)后，可以增強P53蛋白表達(dá)；同時本研究還檢測到P53的靶基因PUMA和BAX的蛋白水平也有上調(diào)(圖1B)。

2.2 敲低PCBP2對FHL家族蛋白表達(dá)的影響

在3株膠質(zhì)瘤細(xì)胞中敲低PCBP2表達(dá)可以抑制FHL2蛋白表達(dá)，但對FHL1蛋白水平?jīng)]有明顯的影響(圖2A)。

2.3PCBP2與FHL家族成員mRNA3′UTR的相互作用分析

針對FHL家族主要成員FHL1、FHL2和FHL3 mRNA的3′UTR上富含胞嘧啶的序列，本研究發(fā)現(xiàn)除了FHL3-3′A與PCBP2可以相互作用，F(xiàn)HL1和FHL2的3′UTR均不能結(jié)合PCBP2(圖2B,C)。

1.control siRNA; 2.PCBP2 siRNA;*Plt;0.05 compared with control siRNA圖1 轉(zhuǎn)染PCBP2 siRNA對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中P53蛋白及其靶基因的影響Fig 1 Effect of PCBP2 siRNA on the expression of P53 protein and its target genes in glioma cells

2.4 敲低PCBP2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響

紅色熒光顯示BrdU陽性的細(xì)胞，藍(lán)色顯示的是通過DAPI染色視野中所有細(xì)胞的胞核。敲低PCBP2表達(dá)后，T98G細(xì)胞中的BrdU陽性細(xì)胞率平均值從49.0%下降到28.4%；U87MG細(xì)胞則從40.8%下降到23.4%；U251細(xì)胞中的平均BrdU陽性細(xì)胞率也從51.6%下降到28.0%(Plt;0.05)(圖3)。

2.5 敲低PCBP2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率的影響

敲低PCBP2的3株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Hoechst染色陽性的細(xì)胞數(shù)比例較對照組(control siRNA)明顯增加(Plt;0.05)(圖4)。

1.control siRNA; 2.PCBP2 siRNA; *Plt;0.05 compared with control siRNA圖2 轉(zhuǎn)染PCBP2 siRNA對FHL家族蛋白的影響Fig 2 Effect of PCBP2 siRNA on the expression of FHL proteins

*Plt;0.05 compared with control siRNA圖3 BrdU摻入法檢測轉(zhuǎn)染PCBP2 siRNA對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

*Plt;0.05 compared with control siRNA圖4 Hoechst染色檢測轉(zhuǎn)染PCBP2 siRNA對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

PCBP2因其能與球蛋白的3′UTR上富含胞嘧啶(C)的序列特異性結(jié)合，以前又被稱為αCP2[7]。本研究的結(jié)果顯示PCBP2參與到P53通路中，提示該蛋白可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。同時本研究在3株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中觀察到敲低PCBP2蛋白對細(xì)胞增殖和抗凋亡能力的抑制作用，暗示PCBP2具有促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展的原癌樣基因功能。

在DNA損傷刺激下，P53能夠促進(jìn)凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。PUMA又稱作P53上調(diào)凋亡調(diào)控因子，它的啟動子區(qū)存在兩個P53結(jié)合區(qū)，與P53蛋白的結(jié)合對于PUMA的轉(zhuǎn)錄非常重要[8]。BAX基因?qū)儆贐CL-2基因家族，對BCL-2產(chǎn)生阻抑作用，也是極重要的促細(xì)胞凋亡基因。P53能夠直接激活BAX，誘導(dǎo)BAX寡聚，介導(dǎo)凋亡[9]。

FHL家族包括FHL1～FHL5共5個成員。FHL2被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤的生長和遷移[10]。同時FHL2還可以與P53和HIPK2形成復(fù)合物，共同介導(dǎo)P53誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[4]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)PCBP2除可以調(diào)節(jié)FHL3，還可以調(diào)節(jié)FHL2表達(dá)，但與FHL3的調(diào)節(jié)機制不同的是，PCBP2并不能結(jié)合FHL2的mRNA上3′UTR，具體調(diào)節(jié)的分子機制還有待進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] Stupp R, Hegi ME, van den Bent MJ,etal. Changing paradigms：an update on the multidisciplinary management of malignant glioma [J]. Oncologist, 2006, 11: 165- 180．

[2] Van Meir EG, Hadjipanayis CG, Norden AD,etal. Exciting new advances in neuro-oncology: the avenue to a cure for malignant glioma [J]. CA Cancer J Clin, 2010, 60: 166- 193.

[3] Vousden KH, Prives C. P53 and prognosis: new insights and further complexity [J]. Cell, 2005, 120: 7- 10.

[4] Lee SW, Kim EJ, Um SJ. FHL2 mediates p53-induced transcriptional activation through a direct association with HIPK2 [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 339: 1056- 1062.

[5] Han W, Xin Z, Zhao Z,etal. RNA-binding protein PCBP2 modulates glioma growth by regulating FHL3 [J]. J Clin Invest, 2013, 123: 2103- 2118.

[6] Zhang Y, Chao T, Li R,etal. MicroRNA-128 inhibits glioma cells proliferation by targeting transcription factor E2F3a [J]. J Mol Med, 2009, 87: 43- 51.

[7] Chkheidze AN, Lyakhov DL, Makeyev AV,etal. Assembly of the alpha-globin mRNA stability complex reflects binary interaction between the pyrimidine-rich 3′ untranslated region determinant and poly(C) binding protein alphaCP [J]. Mol Cell Biol, 1999, 19: 4572- 4581.

[8] Wang P, Yu J, Zhang L. The nuclear function of p53 is required for PUMA-mediated apoptosis induced by DNA damage [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104: 4054- 4059.

[9] Chipuk JE, Kuwana T, Bouchier-Hayes L,etal. Direct activation of Bax by p53 mediates mitochondrial membrane permeabilization and apoptosis [J]. Science, 2004, 303: 1010- 1014.

[10] Li M, Wang J, Ng SS,etal. The four-and-a-half-LIM protein 2 (FHL2) is overexpressed in gliomas and associated with oncogenic activities [J]. Glia, 2008, 56: 1328- 1338.

Knockdown of PCBP2 with small interferingRNA regulates P53 related genes and cell proliferation of glioma cells

HAN Wei, YIN Bin, PENG Xiao-zhong*

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology,Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo study the effect of poly(C) binding protein 2 (PCBP2) silencing on P53 related genes and glioma cell proliferation.MethodsPCBP2 gene-specific siRNA or control siRNA was transfected into three glioma cell lines (T98G, U87MG and U251). The expression levels of PCBP2 protein, P53 and its target genesPUMAandBAX, P53 co-regulator FHL2 and another member of the Four-and-a-half-LIM domain (FHL) family FHL1 were detected by Western blot. The interactions between PCBP2 and FHL family members′ mRNA were analyzed by Biotin pull-down. Cell proliferation was determined by BrdU incorporation. The apoptosis ratio of cells was measured by Hoechst staining.ResultsAfter transfection ofPCBP2 siRNA, PCBP2 protein was evidently silenced; the protein levels of P53 and its target genes PUMA and BAX were increased (Plt;0.05); the protein level of FHL2 was decreased (Plt;0.05) but its mRNA 3′UTR didn′t bind to PCBP2, the BrdU positive cells decreased (Plt;0.05); the number of Hoechst positive cells increased (Plt;0.05).ConclusionsKnockdown of PCBP2 can enhance the activity of P53 pathway in glioma cells with the weakened ability of cell proliferation and induction of cell apoptosis.

RNA interference; poly(C) binding protein 2; P53; cell proliferation; cell apoptosis

2014- 03- 10

2014- 04- 13

國家自然科學(xué)基金(31301152)

*通信作者(correspondingauthor)：pengxiaozhong@pumc.edu.cn

1001-6325(2014)06-0776-06

Q291

A