天皰瘡患者外周血CD4+T細胞活化狀態(tài)及其表面共刺激分子的表達

劉芝翠 元慧杰 曾維宏 張晨星 王穎 鄭捷 潘萌

·論著·

天皰瘡患者外周血CD4+T細胞活化狀態(tài)及其表面共刺激分子的表達

劉芝翠 元慧杰 曾維宏 張晨星 王穎 鄭捷 潘萌

目的探討天皰瘡患者和健康人外周血CD4+T細胞的活化狀態(tài)及其表面共刺激分子的表達情況。方法收集天皰瘡患者90例,其中初發(fā)24例,穩(wěn)定期51例,復發(fā)期15例;健康對照30例。運用流式細胞儀檢測天皰瘡患者外周血CD4+T細胞的活化標志CD69及其表面共刺激分子,包括細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、誘導性協同刺激分子(ICOS)、CD40配體(CD40L)和OX40的表達情況,并和健康對照組進行比較。用Graphpad 5.0軟件進行統計分析,兩組間比較采用非參數(Mann-Whitney test)檢驗。結果天皰瘡患者外周血CD4+T細胞表面CD69表達比例為(2.46±0.19)%,顯著高于健康對照組［(1.26±0.19)%,P＜0.01］,且初發(fā)、穩(wěn)定期和復發(fā)期天皰瘡患者CD4+T細胞表面CD69的表達均顯著高于健康對照組(P＜0.01),但不同病期患者間差異無統計學意義。天皰瘡患者CD4+T細胞表面ICAM-1、CD40L和OX40的表達比例分別為(55.88±1.67)%、(2.23±0.22)%和(2.55±0.29)%,分別顯著高于健康對照組［(47.75±2.52)%、(0.73±0.07)%和(0.62±0.17)%,P＜0.05或0.01］,但在初發(fā)、穩(wěn)定期和復發(fā)期患者之間差異無統計學意義;ICOS的表達在初發(fā)患者中顯著高于健康對照組,分別為(3.73±0.60)%和(2.39±0.16)%(P＜0.05)。結論天皰瘡患者外周血CD4+T細胞處于相對活化的狀態(tài),其表面的共刺激分子也呈高表達,表明CD4+T細胞可能通過高表達的共刺激分子和B細胞相互作用,參與疾病的發(fā)生和發(fā)展。

天皰瘡;T淋巴細胞,輔助誘導;共刺激分子

天皰瘡是一種器官特異性自身免疫性疾病,累及皮膚和黏膜。臨床上主要分為尋常型天皰瘡和落葉型天皰瘡。其經典的發(fā)病機制為患者體內產生直接針對角質形成細胞橋粒結構中的橋粒芯糖蛋白3(desmoglein 3，Dsg3)和(或)橋粒芯糖蛋白1(desmoglein 1，Dsg1)的自身抗體［1］,抗體與抗原分子結合,導致細胞間的黏附能力喪失,出現臨床和病理表現。目前研究發(fā)現,在B細胞活化和分化為抗體產生細胞的過程中,輔助性T細胞(Th細胞)起著重要的輔助作用［2］。除了通過分泌細胞因子對B細胞免疫應答發(fā)揮免疫調節(jié)作用,活化的Th細胞還通過上調表面多種分子,增強T-B細胞間相互作用,傳遞B細胞活化和分化所需要的協同刺激信號,促進B細胞進一步分化為漿細胞產生抗體。目前已經發(fā)現在B細胞活化過程中,參與T-B細胞間相互作用的分子包括細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和其受體淋巴細胞功能相關抗原(lymphocyte functional antigen-1,LFA-1)、誘導性協同刺激分子(inducible co-stimulatory molecule,ICOS)和其配體(ICOS-L)、CD40-CD40L、OX40-OX40L 等, 這些分子共同形成Th細胞與B細胞之間的免疫突觸,介導T-B細胞之間協同刺激信號的傳導,進而促進B細胞活化。為了進一步明確CD4+T細胞在疾病中的作用,我們用流式細胞儀對天皰瘡患者外周血CD4+T細胞的活化狀態(tài)及其表面參與T-B細胞間相互作用的共刺激分子的表達進行初步探討。

對象與方法

一、對象

2012年9月至2013年2月初診并隨訪于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科的天皰瘡患者90例,其中尋常型天皰瘡患者46例,落葉型天皰瘡患者44例。所有患者均根據臨床表現、組織病理、免疫病理和自身抗體檢測明確診斷。根據病程及治療情況,將患者分為3組,即初發(fā)、穩(wěn)定期和復發(fā)期患者,其中未局部或系統應用激素或其他免疫抑制劑治療者為初發(fā)患者;每天口服潑尼松≤15 mg,皮膚黏膜無新發(fā)皮損連續(xù) ≥30 d者為穩(wěn)定期患者;病情穩(wěn)定1個月以上,又出現新發(fā)皮損或黏膜損害為復發(fā)期患者?；颊呓M中初發(fā)患者24例,穩(wěn)定期患者51例,復發(fā)期患者15例。健康對照外周血來自健康捐獻者,共計30例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準,患者簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

R-藻紅蛋白(PE)-鼠抗人CD69產自美國eBioscience公司;異硫氰酸熒光素(FITC)-鼠抗人CD4、太平洋藍(Pacific blue)-鼠抗人 CD4、PECyTM5-鼠抗人 CD54(ICAM-1)、PE-抗人 CD278(ICOS)、別藻藍蛋白(APC)-鼠抗人CD154(CD40L)和FITC-鼠抗人CD134(OX40)產自美國BD公司;LymphoprepTM淋巴細胞分離液產自挪威Axis-shield公司;FACS CantoⅡ流式細胞儀產自美國BD Bioscience公司。

三、方法

1.外周血單一核細胞(PBMC)分離:健康人和天皰瘡患者外周血4 ml,肝素抗凝,用淋巴細胞分離液經密度梯度法分離獲得外周血淋巴細胞。

2.流式細胞儀檢測PBMC中CD4+T細胞的活化標志及表面共刺激分子的表達:每2×105個細胞重懸于100 μl PBS,根據不同流式抗體組合,按照抗體與PBS的體積比例1∶100分別加入熒光抗體:Pacific Blue-抗人 CD4、FITC-抗人 CD4、PE-抗人 CD69、PECyTM5-抗人 ICAM-1、PE-抗人 ICOS、APC-抗人-CD40L和FITC-抗人OX40,室溫下避光孵育30 min,用PBS洗滌1次后,2%多聚甲醛固定,用FACS CantoⅡ流式細胞儀和Flowjo軟件檢測和分析。

3.統計學方法:用Graphpad 5.0統計軟件進行統計分析,所有數據以表示。用非參數檢驗(Mann-Whitney test)比較兩組間的差異,P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、天皰瘡患者外周血CD4+T細胞的活化狀態(tài)

圖1 天皰瘡患者(1a)與健康對照(1b)外周血CD4+T細胞活化狀態(tài)比較

圖2 天皰瘡患者與健康人外周血CD4+T細胞表面細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、協同共刺激分子(ICOS)、CD40的配體(CD40L)和OX40的表達比較

天皰瘡患者外周血CD4+T細胞表面CD69的表達比例為(2.46±0.19)%,顯著高于健康對照組(1.26±0.19)%,差異有統計學意義(P＜0.01,圖1a,1b);初發(fā)、穩(wěn)定期和復發(fā)期天皰瘡患者CD4+T細胞表面CD69的表達比例分別為(2.77±0.40)%、(2.15±0.25)%和(2.36±0.35)%,與健康對照組相比較均有顯著升高(均P＜0.01),而患者組之間差異無統計學意義。

二、天皰瘡患者外周血CD4+T細胞表面共刺激分子的表達

與健康對照相比較,天皰瘡患者來源的CD4+T細胞表面ICAM-1的表達比例為(55.88±1.67)%,CD40L為(2.23±0.22)%,OX40為(2.55±0.29)%,均顯著高于健康對照組［(47.75±2.52)%、(0.73±0.07)%和(0.62±0.17)%,P＜0.05或0.01)］;ICOS的表達雖然有升高,但差異無統計學意義(圖2)。

三、天皰瘡不同病期患者之間CD4+T細胞表面共刺激分子的表達

CD40L在初發(fā)、穩(wěn)定期和復發(fā)期患者的表達水平為(2.16±0.28)%、(2.08±0.26)%和(2.20±0.68)%,均顯著高于健康對照組［(0.72±0.07)%,均P＜0.01］,但不同分期患者之間CD40L的表達差異無統計學意義(表1);OX40在初發(fā)、穩(wěn)定期和復發(fā)期患者的表達水平為(2.44±0.43)%、(2.46±0.38)%和(1.53±0.34)%,均顯著高于健康對照組的(0.62±0.17)%(均P＜0.01),不同分期患者之間OX40的表達差異無統計學意義(表1);ICOS的表達雖然在整體水平未顯示出明顯差異,但在初發(fā)期患者CD4+T細胞表面的表達比例為(3.73±0.60)%,顯著高于健康對照組的(2.39±0.16)%(P＜0.05,表1);而ICAM-1的表達雖然整體水平高于健康人,但不同分期患者之間及分別與健康人相比較差異均無統計學意義(圖2,表1)。

表1 不同病期天皰瘡患者之間CD4+T細胞表面共刺激分子表達比較

表1 不同病期天皰瘡患者之間CD4+T細胞表面共刺激分子表達比較

注:與健康人比較,a:P ＜0.05,b:P＜0.01

組別 例數 黏附分子1 誘導性協同刺激分子 CD40L OX40健康對照組 30 48.52±2.56 2.39±0.16 0.72±0.07 0.62±0.17天皰瘡組穩(wěn)定期 51 54.73±2.06 2.53±0.21 2.08±0.26b 2.46±0.38b復發(fā)期 15 56.08±3.94 2.99±0.59 2.20±0.68b 1.53±0.34b初發(fā) 24 54.97±3.30 3.73±0.60a 2.16±0.28b 2.44±0.43b

討 論

Nishifuji等［3］通過酶聯免疫斑點法(ELISPOT)分析發(fā)現,尋常性天皰瘡患者外周血T細胞和Dsg3在體外可刺激自身反應性B細胞活化和分泌抗Dsg3自身抗體,而當CD4+T細胞耗竭時,自身反性B細胞活化和Dsg3自身抗體產生缺失。Takahashi等［4］在尋常型天皰瘡小鼠模型中,通過將Dsg3特異性CD4+T細胞和從Dsg3免疫的Dsg3-/-小鼠中獲得的B細胞一起過繼轉移到Rag-2-/-小鼠體內,可以誘導受體鼠產生典型的疾病表型,抗Dsg3 IgG抗體的產生和皮膚棘層松解性大皰形成。本課題組證實在天皰瘡中Th2-B細胞的相互接觸對抗體的產生是必不可少的［5］,而且T-B細胞體外共培養(yǎng)實驗證明,ICAM-1和ICOS不同程度地參與活化的CD4+T細胞促進B細胞產生抗體［6］。因此,研究天皰瘡患者體內CD4+T細胞活化狀態(tài)、功能以及表面參與T/B細胞相互作用的共刺激分子表達情況,對進一步解釋天皰瘡自身抗體的產生具有重要意義。

目前,國內外尚未見通過共刺激分子來明確天皰瘡患者T細胞對B細胞產生抗體的輔助作用的研究,但這些分子在其他疾病或疾病模型中有一定的研究。如Su等［7］研究表明,SLE患者與健康人相比較外周血單一核淋巴細胞中CD69/CD3的比值明顯升高,與SLE疾病活動性評分(SLEDAI)具有高度相關性。ICAM-1和LFA-1作為介導細胞間相互作用的一對重要的黏附分子,也是與T細胞和B細胞活化密切相關的協同刺激受體和配體,影響T、B淋巴細胞的激活、增殖和分化［8］。在B細胞的活化過程中。Carrasco等［9］利用平面脂雙層和ICAM-1融合綠色熒光蛋白的細胞,證明ICAM-1和LFA-1的相互作用通過增強B細胞的黏附和促進免疫突觸形成,降低B細胞活化的閾值,促進B細胞的活化。目前研究發(fā)現,ICAM-1的表達異常和SLE、多發(fā)性硬化、甲狀腺炎和胰島素依賴型糖尿病等的發(fā)生有關。CD40L和CD40是B細胞所需要的接觸介導信號中的一個非常關鍵的分子,參與介導T細胞與B細胞之間的共刺激信號的轉導。Aoki-Ota等［10］采用尋常型天皰瘡小鼠模型,在過繼轉移前,給予小鼠抗CD40L抗體,基本完全阻斷了抗Dsg3的IgG抗體的產生和大皰的形成,誘導Dsg3的免疫耐受可持續(xù)70 d,甚至在重新免疫或過繼轉移免疫后的Dsg-/-脾臟細胞后仍可以維持,提示CD40L-CD40相互作用參與致病性抗Dsg3 IgG抗體的產生。OX40(CD134)主要表達在活化的T細胞上,通過與表達在B細胞上的配體OX40L結合,傳遞協同刺激信號,促進T細胞依賴的B細胞增殖和分化［11］,增加抗體的產生。研究表明,OX40在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮作用,如OX40在狼瘡腎炎患者CD4+T細胞表面的表達顯著升高,并且與疾病的活動性相關［12］。本研究顯示,與健康人CD4+T細胞相比較,天皰瘡患者外周血來源的CD4+T細胞表面CD69的表達升高,同時其表面的共刺激分子ICAM-1、CD40L和OX40的表達亦顯著高于健康對照組,ICOS的表達在初發(fā)患者顯著高于健康對照組。另外,我們的結果還顯示,不同分期患者CD4+T細胞表面CD69、CD40L和OX40均高于健康對照組,而這些分子在初發(fā)期、穩(wěn)定期和復發(fā)期患者之間未顯示出明顯差異。上述結果表明,天皰瘡外周血CD4+T細胞通過其表面高表達共刺激分子和B細胞相互作用,進而促進自身抗體的產生,誘發(fā)天皰瘡的發(fā)病和進展,但該作用可能在疾病的不同病期間沒有明顯差異。

值得一提的是,我們發(fā)現ICOS的表達在患者和健康人之間差異無統計學意義,但在初發(fā)患者中的表達明顯升高。ICOS和ICOSL是T-B細胞之間相互作用的協同刺激分子之一,傳遞正向信號。研究表明ICOSL缺失的小鼠模型中,由于缺少T細胞對B細胞的輔助,其Th細胞介導的體液免疫應答受損,生發(fā)中心形成受損,并且血清中抗體的類型異常,IgG和IgE水平降低［13］。 ICOS主要表達在活化的T細胞上,參與生發(fā)中心的形成、抗體的類別轉換和記憶性B細胞的形成［14］。我們的結果提示ICOS可能在疾病初期發(fā)揮明顯輔助B細胞活化的作用,但在激素或免疫抑制劑的作用下,更容易較快出現下調。而其他共刺激分子的相繼活化,使效應進一步放大,更好地完成T-B細胞間的相互作用。

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2013-05-09)

(本文編輯:尚淑賢)

Activation state of and expressions of surface co-stimulatory molecules on peripheral CD4+T cells from patients with pemphigus

Liu Zhicui*，Yuan Huijie，Zeng Weihong，Zhang Chenxing，Wang Ying，Zheng Jie，Pan Meng.*Department of Dermatology，Ruijin Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200025，China

Pan Meng，Email：panmeng@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the activation state of and expressions of surface co-stimulatory molecules on peripheral CD4+T cells from patients with pemphigus and healthy human controls.MethodsNinety patients with pemphigus including 24 patients with first-onset pemphigus，51 with quiescent pemphigus and 15 with recurrent pemphigus，as well as 30 healthy human controls were enrolled in this study.Peripheral blood samples were obtained from these subjects followed by lymphocyte isolation.Flow cytometry was performed to detect the expressions of CD69，intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)，inducible co-stimulatory molecule(ICOS)，CD40 ligand(CD40L)and OX40 on CD4+T cells.Statistical analysis was done by Mann-Whitney test using Graphpad 5.0 software.ResultsThe expression rate of CD69 on peripheral CD4+T cells from the healthy human controls was significantly lower than that from patients with pemphigus，patients with first-onset pemphigus，patients with quiescent pemphigus，and patients with recurrent pemphigus((1.26±0.19)%vs.(2.46±0.19)%，(2.77±0.40)%，(2.15±0.25)%and(2.36±0.35)%，allP＜0.05).The patients with pemphigus also showed a significant increase in the expression rates of ICAM-1，CD40L and OX40 compared with the healthy human controls((55.88±1.67)%vs.(47.75±2.52)%，P＜0.05；(2.23±0.22)%vs.(0.73±0.07)%，P＜0.01；(2.55±0.29)%vs.(0.62±0.17)%，P＜0.01).No significant differences were observed between patients with different stages of pemphigus in the expression rates of CD69，ICAM-1，CD40L or OX40(allP ＞ 0.05).The percentage of ICOS-expressing CD4+T cells was significantly up-regulated in only patients with first-onset pemphigus as compared to the healthy controls((3.73±0.60)%vs.(2.39±0.16)%，P＜0.05).ConclusionsThe peripheral blood CD4+T cells from patients with pemphigus are in a relatively active state with up-regulated surface expressions of many costimulatory molecules，suggesting that CD4+T cells are involved in the initiation and progression of pemphigus by interacting with B cells through co-stimulatory molecules.

Pemphigus；T-lymphocytes，helper-inducer；Costimulatory molecule

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.003

國家自然科學基金(81171499);上海市科委科研計劃項目(10JC1410600)

200025上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科(劉芝翠、元慧杰、鄭捷、潘萌);上海交通大學醫(yī)學院,上海市免疫學研究所(曾維宏、張晨星、王穎)

潘萌,Email:panmeng@medmail.com.cn